三聚氰胺酶聯(lián)免疫分析
試劑盒使用說明書
本試劑盒僅供研究使用。
1 使用目的：
本試劑盒用于飼料、肉類組織（如雞、牛肉和豬肉），雞蛋、牛奶中三聚氰胺殘留的定量檢測。
2 實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒采用競爭ELISA 方法，在微孔板包被有三聚氰胺偶聯(lián)抗原，加入三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離三聚氰胺與微孔條上預(yù)包被的三聚氰胺偶聯(lián)抗原互相競爭抗三聚氰胺抗體酶標(biāo)記物，用TMB 底物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在450nm 波長下進(jìn)行檢測，吸光值與樣品中三聚氰胺含量成反比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中三聚氰胺的含量。
3 工作液準(zhǔn)備
3.1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb
3.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20（1+19）稀釋備用
3.3 *：用蒸餾水按1:10（1+9）稀釋備用
3.3 顯色劑：已備用，避免光線直照
3.4 反應(yīng)終止液：已備用
4 樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴(yán)格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則會出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）
4.1取10g粉碎的樣品，加20ml 70%甲醇溶液
4.2強(qiáng)力振蕩3分鐘
4.3用Whatman 濾紙過濾
4.4取25μl處理后的樣品，加入25μl*于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2）
5 酶免分析步驟
5.1 實(shí)驗(yàn)須知
5.1.1 實(shí)驗(yàn)開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時間約2小時?；販刂潦覝兀?/span>25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的度和準(zhǔn)確度。
5.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存
5.1.3 請不要改變分析程序
5.1.4 請使用的微量移液器
5.1.5 操作一旦開始，請不要中斷任何程序
5.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請嚴(yán)格按照要求操作
5.1.7 為避免交叉污染，每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣
5.1.8 加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面
5.2 分析步驟
5.2.1 預(yù)*行編號，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測
5.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存
5.2.3 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液（蒸餾水或去離子水稀釋）
5.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液
5.2.5 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液
5.2.6 在各樣品孔中加入50μl樣品溶液
5.2.7 在所有孔中加入50μl的抗三聚氰胺抗體酶結(jié)合物
5.2.8 輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘。
5.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）
5.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。
5.4 反應(yīng)
5.4.1 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中先加入50μl顯色液A，再加50μl顯色液B；輕微晃動反應(yīng)板使之*混勻
5.4.2 37℃溫浴10min
5.4.3 每孔中加入50μl終止液，混勻
5.4.4 在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。
6 結(jié)果計(jì)算
6.1定量分析
6.1.1所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
6.1.2以三聚氰胺濃度的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為三聚氰胺濃度的對數(shù)值，求得反對數(shù)即為測定液中三聚氰胺濃度C（ppb）
6.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。
6.2 半定量測定
6.1.1目測半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。
6.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。
7 特異性
物質(zhì)交叉反應(yīng)
三聚氰胺 100%
8 試劑盒參數(shù)
本試劑盒檢測下限為0.05ppb
B0吸光度*值應(yīng)大于1.0
試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％。
用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。
9 標(biāo)準(zhǔn)曲線模式（僅供參考）
試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1ppb~8.1ppb 。
10 分析限制
本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。__
