四環素（TCs）酶聯免疫分析ELISA試劑盒

試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用。

1 使用目的：

本試劑盒用于魚、蝦和肉類組織（如雞、牛肉和豬肉），牛奶,蜂蜜中四環素（TCs）殘

留的定量檢測。

2 實驗原理

本試劑盒采用競爭ELISA 方法，在微孔板包被有四環素（TCs）偶聯抗原，加入四環素

（TCs）標準品或樣品，游離四環素（TCs）與微孔條上預包被的四環素（TCs）偶聯抗原互相競爭抗四環素（TCs）抗體酶標記物，用TMB 底物顯色，加入終止液后顏色由藍色變為黃色，用酶標儀在450nm 波長下進行檢測，吸光值與樣品中四環素（TCs）含量成反比，通過標準曲線計算樣品中四環素（TCs）的含量。

3 試劑盒組成

3.1 預包被的四環素（TCs）偶聯抗原的可拆酶標板：1 塊（12 孔×8 條）。

3.2 四環素（TCs）標準品：6 瓶（1ml/瓶），含量分別是： 0 ppb，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7ppb,8.1 ppb。

3.3 抗四環素（TCs）抗體酶結合物：1 瓶（6ml）。

3.4 顯色液A：1 瓶（6ml）。

3.5 顯色液B：1 瓶（6ml）。

3.6 終止液：1 瓶（6ml），2M 硫酸。

3.7 *：1 瓶（10×, 6ml），用于樣品稀釋用。

3.8 濃縮洗滌液：1 瓶（20×，20ml），用于洗板。

3.9 說明書一份。

4 需要而未提供的材料

4.1 設備

4.1.1波長450nm酶標儀。

4.1.2粉碎機。

4.1.3量筒。

4.1.4振蕩器。

4.1.5漏斗。

4.1.6Whatman 或相當的濾紙。

4.1.7微量移液器。

4.2 試劑

4.2.1去離子水或蒸餾水。

4.2.2 甲醇。

5 貯存

5.1 試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍

5.2 未用完的微孔板應該密封干燥保存

6 注意事項

6.1 使用試劑盒前請仔細閱讀說明書。

6.2 不要使用過期試劑盒。

6.3 試劑盒使用前，將試劑恢復至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時。

6.4 標準品中含有四環素（TCs），使用時應特別注意，操作時應帶手套。

6.5 終止液中含有硫酸，使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。

6.6 不同標準品、樣品所用吸頭不能混用，否則會影響試驗結果。

6.7 不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標準品、樣品所用吸頭不得混用，否則會影響實驗結果。

6.8 稀釋樣本時必須用本試劑盒中的*，否則會影響實驗結果

6.9 混合試劑時應避免起泡。

7 工作液準備

7.1 四環素（TCs）標準品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb

7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用

7.3 *：用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用

7.3 顯色劑：已備用，避免光線直照

7.4 反應終止液：已備用

8 樣品處理程序（樣品在提取過程中，要嚴格按說明書操作，提取過程中應準確稀釋，否則會出現結果不準確，樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存）

8.1取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液

8.2強力振蕩3分鐘

8.3用Whatman 濾紙過濾

8.4取25μl處理后的樣品，加入25μl*于反應孔中（樣本稀釋倍數為2）

9 酶免分析步驟

9.1 實驗須知

9.1.1 實驗開始前請將所有試劑于盒外充分恢復至室溫（25±2℃），時間約2小時。回溫至室溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存

注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的度和準確度。

9.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存

9.1.3 請不要改變分析程序

9.1.4 請使用的微量移液器

9.1.5 操作一旦開始，請不要中斷任何程序

9.1.6 ELISA結果的可重復性極大程度的取決于操作程序，請嚴格按照要求操作

9.1.7 為避免交叉污染，每個標準品和樣品均應使用不同的吸頭加樣

9.1.8 加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內表面

9.2 分析步驟

9.2.1 預*行編號，標記B0、標準品和樣品的位置，推薦進行雙孔檢測

9.2.2 取所需數量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存

9.2.3 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)

9.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml標準品溶液

9.2.5 在各標準孔中加入50μl的標準品溶液

9.2.6 在各樣品孔中加入50μl樣品溶液

9.2.7 在所有孔中加入50μl的抗四環素（TCs）抗體酶結合物

9.2.8 輕輕晃動反應板幾秒鐘。

9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時輕拍反應板，可以減少雙孔誤差）

9.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，zui后一次應在吸水紙上拍打以*除去孔中液體。

9.4 反應

9.4.1 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中先加入50μl顯色液A，再加 50μl顯色液B；輕微晃動反應板使之*混勻

9.4.2 37℃溫浴10min

9.4.3 每孔中加入50μl終止液，混勻

9.4.4 在450nm下檢測吸光度，結果在5min內讀取。

10 結果計算

10.1定量分析

10.1.1所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個標準（0標準）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0μg/L標準溶液的平均吸光度值

10.1.2以四環素（TCs）濃度的對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。根據樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對應點的橫坐標，即為四環素（TCs）濃度的對數值，求得反對數即為測定液中四環素（TCs）濃度C（ppb）

10.1.3由于樣品經過了預先稀釋，因此根據標準曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數。

10.2 半定量測定

10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個適當的標準液與樣品同運行，根據樣品與標準品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值。

10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個適當的標準液與樣品同運行，根據樣品與標準品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值。

11 特異性

物質 交叉反應

四環素（TCs） 100%

二甲胺四環素 125%

吡四環素 110%

* 45%

* 100%

脫甲基* 35%

* 58%

12 試劑盒參數

本試劑盒檢測下限為0.05ppb

B0吸光度*值應大于1.0

試劑盒吸光度板內誤差小于8％，板間誤差小于15％。

用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。

13 標準曲線模式（僅供參考）

試劑盒提供的標準曲線范圍為0.1ppb~8.1ppb 。

14 分析限制

本試劑盒檢測為陽性的樣品應該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。__