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上海哈靈生物科技有限公司
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質粒小量抽提試劑盒
2014-12-10 閱讀(606)
| 提 供 商 | 上海哈靈生物科技有限公司 | 資料大小 | 213.3KB |
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質粒小量抽提試劑盒使用說明：
1. 取過夜菌1.5毫升，5000g離心1分鐘收集細菌沉淀，棄上清。再重復一次，每管共收集3毫升過夜菌沉淀。
通常大腸桿菌宜用LB培養過夜(16小時左右)至OD值為2-4。建議5000g(通常為5000rpm左右)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當延長離心時間。時間過長或離心速度過快會使沉淀過于緊密，不利于加入溶液I后散開沉淀。直接倒掉上清，再倒入約1.5毫升菌液并重復上述操作，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。如果細菌密度明顯偏低，可考慮使用更多菌液，再重復上述操作1-2次。對于高拷貝質粒所用菌量一般不能超過5毫升，對于低拷貝質粒所用菌量一般不能超過10毫升。過量的細菌會導致后續的裂解不充分。 粒轉細胞效果，建議使用
2. 每管加入250微升溶液I，重懸細菌沉淀。確保沉淀*散開，無可見細菌團塊。
確認溶液I中已經添加了RNase A。zui高速度vortex 5-10秒或更長時間，懸起沉淀。一定要充分混勻，對著光亮處觀察應呈
均勻的懸濁液，無明顯細菌團塊或絮塊。如果沒有vortex，可以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開或用手指把沉淀彈開。
3. 每管加入250微升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，使細菌*裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會導致基因組DNA斷裂，易導致zui終所得質粒被基因組DNA污染。顛倒4-6次后，溶
液應變得透明，無團塊或絮狀物。如果加入溶液I后細菌沒有*散開，那么顛倒4-6次后，可能還會有團塊或絮狀物。遇
到有少量團塊或絮狀物產生的情況，可以增加顛倒次數3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時間不可超過5分鐘。
4. 每管加入350微升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產生。
切勿vortex！顛倒次數也不宜過多，否則易導致zui終所得質粒的質量下降。
5. zui高速(13,000rpm左右)室溫離心10分鐘。
離心后會產生白色沉淀。離心時準備好下一步需使用的質粒純化柱，廢液收集管，并在純化柱上做好標記。
6. 將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質粒純化柱內。zui高速離心30-60秒，倒棄收集管內液體。
質粒倒入質粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留收集管繼續使用。
7. 在質粒純化柱內加入750微升溶液IV，zui高速離心30-60秒，洗去雜質，倒棄收集管內液體。
加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留收集管繼續使用。
8. zui高速再離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇*揮發。
注意：倒棄收集管內液體后再離心，才能*去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質粒的質量。
9. 將質粒純化柱置于1.5毫升離心管上，加入50微升溶液V至管內柱面上，放置1分鐘。
溶液V 需要直接加至管內柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果不慎將溶液 V 沾在管壁上，一定要震動管子，使液體滑
落到管底，以便被純化柱吸收。也可以用重蒸水或 MiliQ 級純水替代溶液V，但是水的pH 應不小于6.5。溶液V 加入后
放置時間稍長，對于增加質粒產量會略有幫助。
10. zui高速離心1分鐘，所得液體即為高純度質粒。
通常所得質粒濃度為0.1-0.3mg/ml左右。如果想得到高濃度的質粒，可以采用常規的乙醇沉淀方法濃縮質粒。
