在酶標記過程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價高及抗原親和力強的抗體球蛋白.
目前應用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用zui廣。
1.辣根過氧化物酶（HRP） 過氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量zui高，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構成的一種糖蛋白（含糖量18％），分子量約40 000，約由300個氨基酸組成，等電點為pH 3-9，催化反應的zui適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50％飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的zui大吸收光譜分別為275nm和403nm。
酶的純度以RZ表示：RZ＝OD403/OD275 純酶的RZ多在3.0以上，zui高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75％，不能用于標記。RZ在2.5以上者方可用于標記。HRP的作用底物為過氧化氫，催化反應時的供氫體有幾種：
（1）鄰苯二胺（OPD），產物為橙色，可溶性，敏感性高，zui大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應，顏色可在數小時內不改變,是目前國內ELISA中zui常用的一種；
（2）聯大茴香胺（OD）,產物為橘黃色，zui大吸收值在400nm，顏色較穩定；
（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產物為深棕色，zui大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性較差；
（4）鄰聯甲苯胺（OT）產物為藍色，zui大吸收值在630nm，部分溶解，不穩定，不耐酸，但反應快，顏色明顯。
2.堿性磷酸酶 系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個同功酶組成。它們的底物種類很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價無毒性。酶解產物呈黃色，可溶，zui大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應系統中，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個單位。
抗體的活性和純度對制備標記抗體至關重要，因為特異性免疫反應隨抗體活性和純度的增加而增強。
