一、準備工作
準備工作對開展細胞培養異常重要,工作量也較大,應給予足夠的重視,準備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行.準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒,培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌,無菌室或超凈臺的清潔與消毒,培養箱及其他儀器的檢查與調試,具體內容可參閱有關文獻.
二、取材
在無菌環境下從機體取出某種組織細胞,經過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)后接入培養皿中,這一過程稱為取材.如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程.機體取出的組織細胞的培養稱為原代培養。
三、培養
將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養.如系組織塊培養,則直接將組織塊接入培養器皿底部,幾個小時后組織塊可貼牢在底部,再加入培養基.如系細胞培養,一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數,按要求以一定的量接入培養器皿并直接加入培養基.細胞進入培養器皿后,立即放入培養箱中,使細胞盡早進入生長狀態.
正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次,觀察的內容包括細胞是否生長良好,形態是否正常,有無污染,培養基的PH是否太酸或太堿,此外對培養溫度和CO2濃度也要定時檢查.
四、凍存及復蘇
為了保存細胞,特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株,要將細胞凍存.凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃,將細胞收集至凍存管中加入含保護劑的培養基,以一定的冷卻速度凍存,zui終保存于液氮中.在極低的溫度下,細胞保存的時間幾乎是無限的.
復蘇一般采用快融方法,即從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水中,使之在一分鐘內迅速融解.然后將細胞轉入培養器皿中進行培養.
