間接法的原理
標本中的待檢抗體與固相抗原結合后，利用酶標與抗體（抗人Ig）進行檢測。
測定抗體的簡接ELISA法。病原體或其他外源大分子物質進入機體后都可能刺激機體產生相應的抗體，所以可以通過檢測某種病原體的相應抗體來判斷機體是否曾經被某種病原體所感染，達到診斷的目的。
間接法是測定抗體zui常用的方法。該方法首先將已知定量的抗原（如某個病原體的蛋白質）吸附（也稱包被）與固相載體（微孔滴定板的微孔內），加入待檢測的樣品（如病人血清含相應抗體為*抗體）與之結合。溫育反應一定時間。此時，如果血清中含有該病原體蛋白質的抗體（*抗體）時，則該抗體與固相抗原發生特異性結合，然后，加入酶標抗球蛋白抗體（第二抗體即酶標抗抗體，如血清為人血清，則加入抗人抗體的抗體），該酶標抗抗體就與已知固相抗原結合的*抗體結合，形成抗原—抗體—酶標第二抗體的復合物，同樣保溫、洗滌后加入無色的酶底物，保溫一定時間進行酶促反應，酶催化底物顯色，觀察反應后顏色的有無及深淺來判斷反應結果。若有顏色反應，說明檢測樣品中含有相應的抗體，所以是陽性反應。根據顏色深淺，還可以進行定量分析。反之，若無色，說明樣品中無相應抗體，為陰性反應。
間接法的操作步驟
1、包被固相載體：用已知抗原包被固相載體，形成固相抗原，洗滌除去未結合的抗原和雜質；
2、封閉：用高濃度無關蛋白封閉，阻止待檢血清中非特異IgG吸附固相；
3、加待檢樣本：經過溫育（37℃ 2h），使相應抗體與固相抗原結合。洗滌，除去無關的物質；
4、加酶標抗抗體或酶標SPA：再次溫育（37℃ 2h），使酶標抗抗體與 固相載體上抗原抗體復合物結合，形成固相抗原—待檢抗體—酶標抗抗體（酶標SPA）復合物；洗滌，除去未結合的酶標抗抗體；
5、加底物顯色：溫育（37℃ 30min）；
6、終止反應判定結果，目測定性或用酶標儀測光密度進行定量分析。
間接法的方法評價
酶聯免疫間接法是檢測抗體zui常用的方法，應用廣泛，敏感，應用一種酶標抗抗體可以用于檢測一個種系內各種抗原的相應抗體。
間接法的應用
間接ELISA法主要用于抗體的檢測。運用此法可以檢測：人類免疫缺陷病毒HIV（-1/2）抗體，丙型肝炎病毒抗體（抗HCV），戊肝抗體（抗HEV），庚肝抗體（抗HGV）等。以檢測丙型肝炎病毒抗體為例，如下：
檢測丙型肝炎病毒的適應癥為：用于檢測血清或血漿中丙型肝炎抗體，供獻血員篩選機臨床輔助診斷。其原理為：將HCV結構區核心蛋白和非結構區蛋白的混合抗原包被于微孔條，樣品加到固相抗原板上，當樣品中含有HCV特異性抗體（*抗體時），則該抗體與固相抗原發生特異性結合，然后加入過氧化物酶標記的抗人（IgG），則該抗體與固相抗原發生特異性結合，然后加入過氧化物酶標記的抗人IgG抗體（第二抗體），該酶標抗體就與已和固相抗原結合的*抗體結合，形成抗原—抗體—酶標第二抗體的復合物，再加底物，酶催化底物顯色。在因性反應中，因樣品中不含HCV的抗體，酶標抗體不能與之結合，故無顏色變化。
