禽流感病毒RT-PCR檢測試劑盒使用說明書
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【試劑盒簡介】
禽流感病毒RT-PCR 檢測試劑盒，采用反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR ）技術檢測禽組織、分泌物和排泄物中所有亞型的AIV，適用于AIV的檢測、診斷和流行病學調查。
【試劑盒原理】
利用吸附柱提取RNA作為模板，在反轉錄酶的作用下，以引物為起點合成與RNA 模板互補的cDNA鏈；然后在DNA 聚合酶的作用下，經高溫變性、低溫退火和中溫延伸的多次循環，使特異DNA 片段的拷貝數放大數百萬倍。將擴增的DNA 片段進行電泳、染色后，在紫外燈下，肉眼可見DNA 片段的擴增帶。
【試劑盒組份】
1. 裂解液 | 8mL | N. 陰性對照 | 500μL |
2. BME | 85μL | 6. 吸附柱和收集管 | 12套 |
3. 異丙醇 | 8mL | 7. 0.2 mL 薄壁PCR 管 | 15個 |
4. 洗滌液 | 15mL | 8. 50 倍TAE 電泳緩沖液 | 20mL |
5. 洗脫液 | 500μL | 9. 染色液 | 20μL |
P. 陽性對照 | 500μL | 10. RT-PCR 反應液A | 220μL |
| | 11. RT-PCR 反應液B | 16μL |
注：塑料袋內試劑（陽性對照、RT-PCR反應液A和B）-20 ℃凍存，裂解液2-8℃冷藏，其他室溫保存。
【注意事項】
1．各種事件請在規定的溫度保存。
2．本試劑盒有效期為6個月，不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的組分不要混用。
3．所有試劑應在規定的溫度儲存，使用時拿到室溫下，使用后立即放回。
4．保存-20℃的試劑使用前請*融化，瞬離15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取。
5．嚴格按試劑盒說明書操作可以獲得的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
6．RNA提取過程中，應戴口罩、勤換手套，盡量縮短操作時間。
7．所有接觸病料的物品均應合理處理，以免污染實驗室。
【操作方法】
一、樣品制備
1樣品采集：病死或撲殺的禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，置于50%gan油生理鹽水中，2～8 ℃保存。（要求送檢病料新鮮，嚴禁反復凍融。）
2樣品處理：
2.1 組織樣品的處理：稱取組織0.1g于研磨器中磨碎，再加1mL生理鹽水繼續磨至無塊狀物；然后將樣品轉至1.5 mL滅菌離心管中，8000 rpm離心2 min，取200 µL上清于1.5 mL 滅菌離心管中。
2.2 全血樣品的處理：待血凝后取200 µL血清于1.5 mL 滅菌離心管中。
2.3 陽性對照的處理：混勻后，8000rpm離心20min，取 200 µL上清于1.5 mL 滅菌離心管中。
2.4 陰性對照的處理：混勻后取200 µL于1.5 mL 滅菌離心管中。
二、病毒RNA的提取
1. 往裂解液中加入77.6μL BME，充分混勻。（加入了BME的裂解液請存放4℃保存）
2. 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入600µL裂解液，充分顛倒混勻，室溫靜置10min 。
3. 加入600µL異丙醇，顛倒混勻。
4. 吸取650μL混合液轉入吸附柱中，12,000 rpm 離心45S，棄去收集管中液體，套回收集管。
5. 重復步驟4。
6. 向吸附柱中加入600µL洗滌液，12,000 rpm 離心45S，棄去收集管中液體，套回收集管。
7. 重復步驟6。
8. 空柱12,000rpm 離心2min。
9. 將吸附柱移入新的無RNA酶的1.5 mL離心管中，在膜*加入25µL洗脫液，室溫靜置1min，12,000 rpm 離心45S，獲得總RNA。
三、RT-PCR
1. 反應體系配制：每份總體積20µL，分別取16.8µL RT-PCR反應液A（用前混勻）、1.2µL RT-PCR反應液B（用前混勻）和2µL模板RNA，混勻。
2. 反應程序：在PCR儀上運行以下程序：42 ℃ 45 min，94 ℃ 3 min ；94 ℃ 30 s 、53℃ 30 s 、72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。
四、電泳
1. 取20mL 50倍TAE電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至1000mL。
2. 稱取1.5g瓊脂糖放于250mL的錐形瓶中，加入100mL稀釋好的TAE電泳緩沖液，微波爐加熱溶解，稍稍冷卻后加入10µL染色液混勻，倒入插有梳子的制膠板中。
3.待膠凝固后，取10µL PCR產物點樣于凝膠孔中，以5V/cm的電壓于稀釋好的TAE電泳緩沖液中的電泳，待溴酚蘭指示劑電泳至凝膠下部時結束電泳，在紫外燈下觀察結果。
【結果判斷】
陽性對照出現332bp擴增帶，陰性對照無帶出現（引物帶除外）時，實驗結果成立。被檢樣品出現332bp擴增帶為禽流感病毒陽性，否則為陰性。
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