腹瀉性貝類毒素(DSP)ELISA檢測試劑盒使用說明書貨號：PN520021美國Abraxis*，齊一生物美國Abraxis*代理，更多進(jìn)口原裝農(nóng)殘?jiān)噭┖小?nbsp;（中文說明書僅供參考，應(yīng)以英文說明書為準(zhǔn)）

1.概述

腹瀉性貝類毒素檢測試劑盒的原理是酶聯(lián)免疫吸附測定法，用于水及水產(chǎn)品中腹瀉性貝類毒素的定量測定。岡田酸是腹瀉性貝類毒素的一種。對于水產(chǎn)品需要做前處理，不可以直接檢測。如果需要的話陽性樣品可以通過HPLC和GC/MS來驗(yàn)證。

2.安全性說明書

試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)溶液里含有少量的岡田酸。底物中包含有四甲基聯(lián)苯胺，終止液中含有稀硫酸。要避免

皮膚和粘膜與終止液接觸，如果不小心接觸了請馬上用水沖洗。

腹瀉性貝類毒素(DSP)ELISA檢測試劑盒3．保存和穩(wěn)定性

試劑盒應(yīng)保存在2-8℃，不要冷凍。在使用之前要把試劑盒中的溶液回復(fù)到室溫（20-25℃）。有效期內(nèi)試劑盒中的試劑都可以使用。

4．原理

試劑盒的原理是直接競爭ELISA法，通過特異性抗體來識別岡田酸。當(dāng)樣品中含有岡田酸時(shí)，樣品中的岡田酸與岡田酸酶結(jié)合物競爭結(jié)合溶液中的岡田酸抗體。岡田酸抗體與包被在微孔板上的羊抗鼠二抗結(jié)合。經(jīng)過一步洗滌加入底物溶液，產(chǎn)生有色反應(yīng)。產(chǎn)生的綠色的顏色深度與樣品中岡田酸的含量成反比。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度值。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算樣品中岡田酸的含量。

5. 岡田酸試劑盒的局限性和可能的干擾

對在水樣中經(jīng)常出現(xiàn)的多種有機(jī)物和無機(jī)物已近作過檢測對此試劑盒并無干擾。由于化合物的易變質(zhì)性由基質(zhì)反應(yīng)引起的干擾是不可能*避免的。操作不當(dāng)也可能導(dǎo)致檢測結(jié)果錯(cuò)誤，比如：試劑盒保存條件不對、錯(cuò)誤的加液順序、試劑的量沒有加準(zhǔn)確、孵育的時(shí)間太長或太短、孵育的溫度太高或太低。與其它檢測方法一樣對陽性結(jié)果要求通過其它傳統(tǒng)的方法來驗(yàn)證。

6．岡田酸測定的重要性

岡田酸是腹瀉性貝類毒素的一種，受岡田酸污染的貝類和有害藻類大量繁殖的有關(guān)。DSP可以引起劑量依賴型的腹瀉、惡心、嘔吐癥狀。FDA對ASP的*是0.2ppm。歐洲是160ug。這個(gè)試劑盒可以檢測40個(gè)樣品（做兩個(gè)重復(fù)）。需要少量的樣品，檢測時(shí)間少于2小時(shí)。

腹瀉性貝類毒素(DSP)ELISA檢測試劑盒7．試劑盒特性

敏感性：0.1ng/ml

重復(fù)性：標(biāo)準(zhǔn)的變異系數(shù)小于10%，樣品的變異系數(shù)小于15%

特異性：

腹瀉性貝類毒素檢測試劑盒能檢測Okadaic acid及其它DSP，它們的結(jié)合程度是不同，以下表格中展示的是相關(guān)值及交叉反映率（%CR），以下所有濃度均為ppb級。

樣品：水樣和貝類產(chǎn)品

標(biāo)準(zhǔn)曲線：

A．試劑盒組成：

1、包被二抗的微孔板（羊抗兔）

2、標(biāo)準(zhǔn)（7種）0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、ng/ml

3、岡田酸抗體溶液（兔抗岡田酸）6ml

4、岡田酸酶標(biāo)記物6ml 

5、樣品稀釋液（10倍濃縮）25ml，用于稀釋樣品

6、5x 濃縮洗液100ml

7、顯色液（底物）TMB,16ml

8、終止液12ml

B 測試前準(zhǔn)備

微量移液器和吸頭是必須使用的，使用排槍加液這樣可以確保整個(gè)微孔板上的孔在每個(gè)步驟的反應(yīng)時(shí)間趨于一致。在做同一次測試時(shí)要使用同一個(gè)盒子里的試劑和標(biāo)準(zhǔn)。在操作前仔細(xì)閱讀說明書。

1、使用前將所有的試劑拿到室溫（19℃-25℃）。

2、從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮。置于4-8℃保存。

3、標(biāo)準(zhǔn)液，對照，酶結(jié)合物，底物，終止液不用稀釋直接使用。

4、洗液在使用前要以1：5的比例稀釋后使用（100 mL 5X 洗液加 400 mL 無離子水）

5、由于終止液中含稀硫酸拿的時(shí)候要小心。

C.操作步驟

1、在對應(yīng)的微孔中加入100μL的標(biāo)準(zhǔn)和樣品（做2-3個(gè)重復(fù)）

2、每個(gè)測試孔都加入50 μL岡田酸酶標(biāo)記物溶液。

3、每個(gè)測試孔都加入50 μL岡田酸抗體溶液，用封口膜把微孔板蓋上，輕輕的震蕩微孔板30秒使里面的液體混勻。不要使液體灑出。

4、在室溫下孵育60分鐘。

5、孵育完成后，把封口膜取掉，將微孔中的溶液用力地倒入水槽中，用1 X的洗液洗板3次，每孔每次至少加入250 μL1 X的洗液。拍板，去掉殘留的洗液。

6、每個(gè)測試孔加入150μL的顯色液（底物）。室溫孵育20-30分鐘，此步驟避免太陽光照射。

7、每個(gè)測試孔加入100μL終止液。

8、用酶標(biāo)儀在450nm 下讀取每個(gè)孔的吸光度值（OD）（在加入終止液15分鐘內(nèi)完成）。

D 結(jié)果分析

結(jié)果分析可以利用商業(yè)ELISA分析軟件(4-parameters,Logit/Log)。手工計(jì)算可以先計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值的平均值，然后計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0（用其它標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值除以零標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值乘以99%）。以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的%B/B0做Y軸，以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的岡田酸的濃度做X軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，把樣品的%B/B0代入標(biāo)準(zhǔn)可以計(jì)算出樣品中岡田酸的濃度。樣品中岡田酸的含量小于0.1 ppb認(rèn)為陰性。當(dāng)樣品中岡田酸的含量大于5.0 ppb要稀釋后再測定。

E 劑盒未提供的材料

1、10-200ul和200-1000ul的移液器及吸頭.

2、10-250ul多道移液器及吸頭。

3、酶標(biāo)板洗板儀（可選）

4、450nm的酶標(biāo)儀。 

5、酶標(biāo)板震蕩儀（可選）

F. 工作計(jì)劃

微孔板由12條構(gòu)成，每條8孔。在測試中可以單獨(dú)使用。每次檢測都必須做標(biāo)準(zhǔn)。

Std0-Sd6: 標(biāo)準(zhǔn) 0；0.1；0.2；0.5；1.0；2.0；5.0ppb

Sam1, Sam2， etc.: Samples

G.樣品制備

肌肉樣品:樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存

1. 除去貝殼，用雙蒸水洗凈貝肉后均質(zhì)器均質(zhì)。

2. 稱取1g 均質(zhì)后的樣品加入6ml 80%的甲醇(甲醇80：蒸餾水20)

3. 離心：3500g離心10分鐘，收集上清液。

4.  加2ml80%的甲醇(甲醇80：蒸餾水20)到上步驟中的殘留貝肉組織中再離心：4℃下，3500g離心10分鐘，收集上清液，加入到步驟3收集的上清液中。

5.  重復(fù)步驟4待收集的上清液達(dá)到10ml時(shí)，用0.45um的濾膜過濾。

6.  取100ul濾液，用樣品稀釋緩沖液稀釋到1ml(10倍稀釋)

7.  取100ul用試劑盒進(jìn)行分析，此時(shí)的稀釋倍數(shù)是100。

注意：如樣品中含量低可以將稀釋倍數(shù)降低，例如25倍。如樣品含量很高可以將稀釋倍數(shù)加大，如1000倍。只需要在第6部稀釋過程改變就可以。

腹瀉性貝類毒素(DSP)ELISA檢測試劑盒美國Abraxis 進(jìn)口試劑盒