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齊一生物:關(guān)于基因探針的概念問題

時間:2016-5-31閱讀:362
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 基因探針(probe)就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列,它可以包括整個基因,也可以僅僅是/基因的一部分;可以是DNA本身,也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。 
探針的來源:
DNA探針根據(jù)其來源有3種:一種來自基因組中有關(guān)的基因本身,稱為基因組探針(genomic probe);另一種是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA,再通過逆轉(zhuǎn)錄得到的探針,稱為cDNA探針(cDNA probe)。與基因組探針不同的是,cDNA探針不含有內(nèi)含子序列。此外,還可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補(bǔ)的DNA片段,稱為寡核苷酸探針。 
探針的制備: 
進(jìn)行分子突變需要大量的探針拷貝,后者一般是通過分子克隆(molecular cloning)獲得的。克隆是指用無性繁殖方法獲得同一個體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。當(dāng)制備基因組DNA探針進(jìn),應(yīng)先制備基因組文庫,即把基因組DNA打斷,或用限制性酶作不*水解,得到許多大小不等的隨機(jī)片段,將這些片段體外重組到運(yùn)載體(噬菌體、質(zhì)粒等)中去,再將后者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸桿菌,這時在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑,通過原位雜交,從中可篩出含有目的基因片段的克隆,然后通過細(xì)胞擴(kuò)增,制備出大量的探針。 
為了制備cDNA 探針,首先需分離純化相應(yīng)mRNA,這從含有大量mRNA的組織、細(xì)胞中比較容易做到,如從造血細(xì)胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了 mRNA作模板后,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,就可以合成與之互補(bǔ)的DNA(即cDNA),cDNA與待測基因的編碼區(qū)有*相同的堿基順序,但內(nèi)含子已在加工過程中切除。 
寡核苷酸探針是人工合成的,與已知基因DNA互補(bǔ)的,長度可從十幾到幾十個核苷酸的片段。如僅知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量,也可以按氨基酸的密碼推導(dǎo)出核苷酸序列,并用化學(xué)方法合成。 
探針的標(biāo)記: 
為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交,有必要對探針加以標(biāo)記,以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號,通常采用放射性同位素32 P標(biāo)記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發(fā)展了一些用非同位素如,熒光素等作為標(biāo)記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是保存時間較長,而且避免了同位素的污染。zui常用的探針標(biāo)記法是缺口平移法(nick translation)。

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