免疫染色的方法分析，可在細胞涂片或組織切片上進行免疫染色。一般程序是：①標記抗體與標本中抗原反應(yīng)結(jié)合；②用PBS洗去未結(jié)合的成分；③直接觀察結(jié)果（免疫熒光直接法）；或顯色后再用顯微鏡觀察（免疫酶直接法）。在此基礎(chǔ)上發(fā)展出間接法，多層法，雙標記法等各種方法，將在本書各有關(guān)章 節(jié) 內(nèi)詳述。
在免疫染色中應(yīng)特別注意增強特異性染色，減少或消除非特異性染色。在各種免疫染色中都必須注意以下幾個問題：
1．增強特異性染色的方法
（1）蛋白酶消化法：其作用是暴露抗原，增加細胞和組織的通透性，以便抗體與抗原zui大限度的結(jié)合，增強特異性染色和避免非特異性染色。這種方法已廣泛用于各種免疫細胞化學(xué)染色，常用的蛋白酶有*、*以及*（pronase）等；也可用3mol/L尿素處理切片，達到酶消化的目的。各種酶的配制和使用方法詳見附錄。酶消化的時間和溫度因各種抗原對消化的敏感性不同，應(yīng)根據(jù)酶的活性通過預(yù)試驗確定，消化的時間還與組織固定的時間有關(guān)，一般是陳舊固定組織所需時間長，以37。C為宜。消化時間短的組織可在室溫中進行。消化處理時間過長能損傷組織，易使切片脫落，應(yīng)使用切片粘附劑，消化時間盡量縮短。
（2）合適的抗體稀釋度：抗體的濃度是免疫染色的關(guān)鍵，如果抗體濃度過高，抗體分子過多于抗原決定簇，可導(dǎo)致抗體結(jié)合減少，產(chǎn)生陰性結(jié)果。此陰性結(jié)果并不一定缺少抗原，而是由于抗體過量。這種現(xiàn)象類似于凝集反應(yīng)中的前帶效應(yīng)（Prozone effect ）。因此，必須使用一系列稀釋作“棋盤式效價滴定”檢測抗體的合適稀釋度，以得到zui大強度的特異性染色和zui弱的背景染色。抗體稀釋度應(yīng)根據(jù)：①抗體效價高，溶液中特異性抗體濃度越高，工作稀釋度越高；②一般講，應(yīng)用的抗體稀釋度越大，溫育時間越長。③抗體中非特異性蛋白含量、只有高稀釋度時才能防止非特異性背景染色；④稀釋用緩沖液的種類、標本的固定和處理過程等也可影響稀釋度。所以合適的稀釋度應(yīng)根據(jù)自己的情況測定。抗體的稀釋主要是指*抗體，因為*抗體中特異性抗體合適的嘗試是關(guān)鍵,應(yīng)用高稀釋度*抗體僅顯示主親和力的特異性染色反應(yīng),減少或消除其中交叉抗體反應(yīng)。
（3）溫育時間：大部分抗體溫育時間為30-60min，必要時可4。C過夜（約18h）。溫育的溫度常用37。C，也可在室溫中進行，對抗原抗體反應(yīng)強的以室溫為佳。37。C可增強抗原抗體反應(yīng)；適用于多數(shù)抗體染色，但應(yīng)注意在濕盒中進行，防止切片干燥而導(dǎo)致失敗。
（4）多層染色法：對弱的抗原可用間接法（雙層）、PAP和ABC法（三層）、四或五層PAP法或ABC法，或PAP和ABC聯(lián)合染色法等，可以很大程度的提高敏感性，獲得良好結(jié)果。
（5）顯色增敏劑的應(yīng)用，如在過氧化物酶底物中加入氯化鎳，可提高顯色敏感度4倍。
2．減少或消除非特異性染色的方法 組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色，zui常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠元和結(jié)締組織成分上。zui有效方法是在用*抗體前加制備第二抗體動物之非免疫血清（1：5-1：20）封閉組織上帶電荷基團而除去與*抗體非特異性結(jié)合。必要時可加入2%-5%牛血清白蛋白，可進一步減少非特異性染色。作用時間為10-20min。也可用除制備*抗體以外的其它動物血清（非免疫的）。有明顯溶血的血清不能用，以免產(chǎn)生非特異性染色。免疫熒光染色時，可用0.01%伊文氏蘭(PBS溶液)稀釋熒光抗體,對消除背景的非特異性熒光染色有很好的效果。當(dāng)然使用特異性高、效價高的*抗體是zui重要的條件。洗滌用的緩沖液中加入0.85%~1%NaCl成為高鹽溶液,充分洗滌切片,能有效的減少非特異性結(jié)合而減少背景染色。
3．顯色反應(yīng)的控制 免疫酶染色應(yīng)注意控制：①成色質(zhì)濃度和溫育時間可調(diào)節(jié) ，增加成色質(zhì)的量和/或增加底物溫育時間，可增加反應(yīng)產(chǎn)物強度。著色太深可減少溫育反應(yīng)時間。②過氧化物酶顯色時，H2O2較大濃度將使顯色反應(yīng)過快而致背景加深；過量H2O2可能抑制酶的活性。
4．復(fù)染 根據(jù)所用的染色方法和呈顯顏色等，可選用適當(dāng)?shù)膹?fù)染方法。如陽性結(jié)果呈紅或棕色，則用蘇木素將細胞核染成蘭色，以便定位檢測。也可用1%～2%甲基綠復(fù)染。