影響western blot實驗的幾個因素

Western Blot實驗又稱蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗），它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。

Western blotting是一個步驟繁多的實驗，實驗中的每一步都會對最后的結(jié)果產(chǎn)生影響，下面將為你總結(jié)一些影響實驗結(jié)果的因素：

1. 樣品質(zhì)量

所抽取樣品的蛋白含量，蛋白變性是否充分等等，還有，蛋白樣品的PH值是否在7~8之間。這會直接影響到樣品濃縮的效果。此外，蛋白樣品是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都會對最終結(jié)果的可靠性有影響。

2.凝膠質(zhì)量

不連續(xù)SDS-PAGE膠對凝膠的要求較高，具體的影響因素有：（1）分離膠的PH值應在8.8左右，而濃縮膠的PH應在6.8左右，最好不要差過0.5個PH單位，因為這個PH條件是保證電泳液中的不電離的必要條件，也是保證能充分壓縮樣品的前提。因此，制備凝膠的時候所用Tris-HCl緩沖液的PH值是否穩(wěn)定是很重要的。（2）用丙烯酰胺的純度和凝膠聚合時間，不純的丙烯酰胺會含有丙烯酸，它會影響到凝膠內(nèi)部局部PH環(huán)境，因此會影響電泳的效果，沒有聚合充分的凝膠會含有游離的丙烯酰胺，也會影響到局部PH環(huán)境，它們還會與蛋白上的氨基、巰基以及酚羥基反應影響蛋白的泳動。凝膠聚合時間以分離膠>45min，濃縮膠>20min為宜。此外，單體放置時間過長也會造成丙烯酸的累積。（3）凝膠母液混合是否均勻也會影響到凝膠濃度的分布。（4）配備的母液中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例也會影響到網(wǎng)孔的大小，因此也會對電泳的質(zhì)量有影響。（5）APS及TEMED的加入量，APS極易潮解而失去活性，因此最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，APS不宜加入過多，否則會氧化蛋白樣品。（6）點樣孔底部要平整。

3. 點樣

樣品盡量不要與電泳液混合，這樣能提高濃縮的效果，因為電泳液PH值為8.3，而樣品為7.5，混合后會影響到樣品的PH值，進而影響濃縮效果。因此，建議點樣最好用長qiang頭，或者加樣器，輕輕的將樣品加到孔的底部。還有，加樣之前最好先沖洗一下加樣孔底部，減少沒有聚合的丙烯酰胺的影響。盡量從加樣孔的中間點樣，這樣能使得樣品在加樣孔中的濃度分布盡量均勻，這也會對最終蛋白條帶的形狀有影響的。加樣量也不能過高或過低，過高會影響條帶的形狀，過低不利于后面的雜交反應。

4. 電泳緩沖液

盡量用新鮮配制的。這樣能保證PH值和離子強度的穩(wěn)定。

影響western blot實驗的幾個因素