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信帆生物
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信帆生物代做:mRNA實驗,PCR實驗代測

時間:2016-1-11閱讀:1231
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信帆生物代做mRNA實驗,咨詢!mRNA實驗PCR代測服務(wù)操作流程!

1. 設(shè)計并合成Realtime PCR引物
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進(jìn)行含SG(SYBR Green)的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。
3. RNA抽提
    a. 若實驗對象為組織樣品,取適量(50-100mg)新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品,加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),勻漿后抽提RNA。
    b. 若實驗對象為細(xì)胞樣品,每份樣品取1×106~1×107細(xì)胞,*吸去培養(yǎng)液后加1ml的RNA抽提試劑Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA。
4. RNA質(zhì)量檢測
    a. 紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,以計算其濃度并評估RNA純度。
    b. 使用甲醛電泳試劑(ambion)進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳,檢測RNA純度及完整性。
5. cDNA合成
     按照逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen或Promega)5. 使用說明將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
6. 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(可選)
    進(jìn)行相對定量,需要先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7. 實時定量PCR
     標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTimePCR反應(yīng)液中(其中TaqBead熱啟動聚合酶來自Promega公司),進(jìn)行RealTime PCR擴(kuò)增和檢測
8. 數(shù)據(jù)分析
    檢測結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析,以對待測樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對定量實驗需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差,所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對含量。9. 提供實驗報告:包括詳細(xì)的實驗方法及實時熒光定量PCR實驗結(jié)果及相關(guān)圖表。

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