長知識了！產生組織切片非特異性染色的原因竟然是這些

1、 抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是zui重要的一條。

2、 一抗用多克隆抗體易出現非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。

3、內源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高(含血細胞多的組織)，需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色;

4、 非特異性組分與抗體結合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當增加濃度來加強封閉效果;

5、 DAB孵育時間過長或濃度過高;

6、 PBS沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要;

7、 標本染色過程中經常出現干片，這容易增強非特異性著色。

我的實際解決方案：

以上的分析可能對于初學者還是不容易的，下面我就把我的排除實驗的具體過程與大家進行分享、交流和討論。

1、首先排除抗體孵育條件。一般來說，著色效果的好壞與抗體的孵育條件是密不可分的，由于用SP法已經做出來過一次且效果不錯，因此對于同樣組織的同一抗原進行分析，這種因素可以先排除。

2、其次，DAB孵育時間是否太長?做出來那一次我是孵育8min，后來也是8-10min，我單獨做了一次實驗來排除該因素。結果孵育2、5min時先出現背景，而特異性染色較淺，故這不符合常理，一般先出現特異性染色，然后隨著時間的延長，會出現非特異性背景著色。

3、zui后，血清封閉的問題?以前我一般孵育15-30min，所以我單獨做了一次實驗用血清封閉室溫1h，其它條件同做出來的那一次，結果也一樣背景著色很深。

4、此外，我在改進的同時，也對PBS清洗不斷地延長時間和增加次數，甚至*參照試劑盒說明書來進行操作(我以前一般一抗4度過夜且室溫復溫45min、二抗37度30min、Sp反應37度30min)，以及過氧化氫滅活加強等等均未起到效果。

我冷靜地分析了一下整個實驗流程，與*次做出來相比，只有兩個地方做了改動：因血清不夠而更換了不同廠家試劑盒、因抗體稀釋液用完而重新買了抗體稀釋液。

5、我用PBS替代一抗稀釋液(我以前還回收抗體，自我覺得抗體稀釋液中含防腐劑和蛋白穩定劑)，其它步驟和組織切片*與*次做出來的一致(包括血清也是老試劑盒內剩余的一點)，奇跡出現了：結果很好。--因為抗原抗體反應除溫度、抗原/抗體濃度外，然后就是PH值，于是我測了新抗體稀釋液、老抗體稀釋液和PBS的PH值，結果是前者偏酸性(<6、0)，而后兩者均在7、5左右。

6、看來主要禍根是抗體稀釋液的PH值出問題了，于是又用PBS替代抗體稀釋液和新試劑盒內的試劑對組織切片做了免疫組化，結果還是沒有做出來：背景很深。這真搞慘了。難道還有什么原因嗎?通過仔細分析：一抗一定是結合上去了(老SP試劑盒結果很好)，問題是二抗沒有結合上去也不對(因為zui后背景很深，這說明二抗可能也結合上去了)，DAB孵育時間現在只用1、5min也是背景深而特異性染色淺，那我又懷疑封閉血清了。

7、做了兩張切片：一張用老試劑盒內還剩下一點的血清而另一張用新試劑盒內的封閉血清，其余試劑(二抗、SP)均用新試劑盒提供的，結果是前一張效果很好，而后一張能夠看到特異性染色，但背景太深，拍照效果不佳。--看來封閉血清也是罪會禍首之一。

結果分析顯示：抗體稀釋液的PH值偏低和封閉血清的失效導致了我的免疫組化結果的不佳，望大家在以后的組化實驗中也要注意這兩個不太引人注意的關鍵問題。

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