在一些情況下，例如需要對真核微生物的代謝途徑進行修飾，或者需要表達的真核生物蛋白需要合適的翻譯后修飾才具有生物活性時，就需要采用真核微生物表達載體。真核細胞基因表達調控要比原核細胞基因復雜得多，用于真核細胞的克隆和表達載體也不同于原核細胞。目前所用的真核載體大多是所謂的穿梭載體(shuttle—vector)。

    穿梭載體是指可以在不同宿主細胞中復制的載體，其中的一個宿主通常是大腸桿菌。這種載體必須既含有大腸桿菌或其質粒的復制起點，又含有另一生物或其質粒的復制起點。由于利用大腸桿菌進行重組DNA技術的各種操作都zui為方便，因此通常先利用大腸桿菌體系構建好所需的表達載體并大量復制后，再轉到其他細胞中去表達。

    用于真核生物基因表達的穿梭載體應至少具備以下特征：①含有原核基因的復制起始序列以及篩選標記，以便于在E．coli細胞中進行擴增和篩選；②含有真核基因的復制起始序列以及真核細胞篩選標記；③含有有效的啟動子序列，保證其下游的外源基因能啟動有效的轉錄；④應包含RNA聚合酶II所需的轉錄終止序列和poly A加入的信號序列；⑤具有合適的供外源基因插入的限制性內切酶位點。值得注意的是，與原核宿主一載體系統常用的抗生素抗性標記不同，真核宿主一載體系統所采用的選擇性標記除了kanr基因(抗G418)等少數抗性標記外，更常用的主要是營養缺陷型。例如，通常宿主為某一營養缺陷型(如ura3—52、his3一△ι、leu2一△ι、trpι一△ι和ιys2一201)，而載體上則攜帶相應的基因(如URA3、HIS3、LEU2、TRPι和LYS2)。由于宿主在基本培養基上不能生長，而重組子能夠生長，因此可以用基本培養基來篩選重組子。

    目前研究得比較多的真核微生物表達體系之一是釀酒酵母表達系統。以釀酒酵母為宿主的常見載體有以下幾類。

(1)YEp載體YEp是酵母附加體質粒(yeast episomal plasmid)的縮寫。附加體是指游離于染色體之外的獨立復制DNA分子。YEp載體由大腸桿菌質粒、部分或全部酵母2μ質粒以及酵母染色體的選擇標記構成。由于2μ質粒內含自主復制起點(ori)和使質粒在酵母細胞中穩定存在的STB區，所以這類載體在酵母細胞中獨立存在。

(2)YIp載體YIp是酵母整合型質粒(yeast integrating plasmid)的縮寫。YIp載體由大腸桿菌質粒和酵母的染色體DNA片段組成，可與宿主的染色體DNA同源重組，整合進入宿主染色體中，從而隨宿主染色體一起復制。

(3)YAC載體YAC載體是酵母人工染色體(yeast artificial chromosome)的縮寫，是由酵母染色體中分離出來的DNA復制起始序列(ARS)、著絲點(CEN)、端粒()以及酵母選擇性標記組成的能自我復制的線性克隆載體。YAC載體通常可以以雙鏈環狀DNA的形式在大腸桿菌中復制，然后用限制酶消化成線性分子。多數YAC載體可以克隆250~400kb的外源DNA，在人類基因組計劃中發揮了重要作用。

    除釀酒酵母外，以巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、漢遜多形酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluueryomyces lactis)等為宿主的酵母表達系統也得到迅速發展并被廣泛應用。