一抗4度孵育后為什么要進行37度復(fù)溫？

（1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；

（2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有用，4度和37度時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

（3）其實，我更贊同后一種說法，因為我嘗試把肝臟或*子從4度過夜拿出后，直接用PBS洗沒發(fā)生過脫片現(xiàn)象。事實勝于雄辯！

DAB顯色時間如何把握？

（1）DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)淺棕色本底時即可沖洗；

（2）DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；

（3）此外，若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；

（4）DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短（一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。

免疫組化結(jié)果如何分析？

（1）陽性著色細胞計數(shù)法。在40*光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，人工或機器計數(shù)陽性著色細胞，每組3~6張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。

（2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用image j進行灰密度分析，然后進行統(tǒng)計分析即可。

（3）評分法。通過在光學顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進行評分（1~4分為0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），zui終可以分數(shù)相加，再進行比較。

對于以上這幾種方法，各有利弊，請細心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。