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細胞凋亡(Apoptosis),又稱細胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death),是指細胞在一定的生理或病理條件下,遵循自身的程序,自己結束其生命的過程。它是一個主動的,高度有序的,基因控制的,一系列酶參與的過程。隨著這方面研究的持續升溫,涌現出了大量新的技術和方法對細胞凋亡進行檢測,其中不少已經有商品化的產品出現,大大加速了研究的進程。具體來說,針對凋亡的不同階段有以下一些方法:
早期檢測:
1) PS(磷脂酰*)在細胞外膜上的檢測:
PS從細胞膜內側轉移到外側在細胞受到凋亡誘導后不久發生, 可能作為免疫系統的識別標志。AnnexinV,一個鈣依賴性的磷脂結合蛋白,能專一性的結合暴露在膜外側的PS,再通過簡單的顯色或發光系統進行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細胞檢測(懸浮細胞和貼壁細胞都適用),可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發展階段。
2)細胞內氧化還原狀態改變的檢測:
正常狀態下,谷光苷肽(glutathione:GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要,許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細胞中,細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉移系統。當細胞內GSH的排除非常活躍時,細胞液就由還原環境轉為氧化環境,這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低,從而使*(三羧酸循環中的重要組分)從線粒體內轉移到細胞液中,啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。
由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關,此項檢測除了對研究細胞凋亡的起始非常有用外,還可用于心臟病、中風等疾病治療的研究。但有些細胞如:HeLa 和3T3細胞凋亡時沒有明顯的GSH水平的變化,不能用此法檢測。
3)*的定位檢測
*作為一種信號物質,在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下,它存在于線粒體內膜和外膜之間的腔中,凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞液,結合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后啟動caspase級聯反應:*/Apaf-1復合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase。
*氧化酶亞單位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ:COX4)是定位在線粒體內膜上的膜蛋白,凋亡發生時,它保留在線粒體內,因而它是線粒體富集部分的一個非常有用的標志。Cytochrome c Apoptosis Assay Kit試劑盒可以有效地檢測凋亡過程中*的釋放情況。
4) 線粒體膜電位變化的檢測:
在凋亡研究的早期,從形態學觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機制研究的深入,發現線粒體凋亡也是細胞凋亡的重要組成部分,發生很多生理生化變化。例如,在受到凋亡誘導后線粒體轉膜電位會發生變化,導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM,一個陽離子性的染色劑,對此改變非常敏感,呈現出不同的熒光染色。正常細胞中,它在線粒體中形成聚集體,發出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中,因線粒體穿膜電位的改變,它以單體形式存在于細胞液中,發出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。
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