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上海谷研實業有限公司

細胞活性定磷實驗操作步驟

時間:2015-9-7閱讀:261
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 實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進冰槽里融化。然后進行下列操作。
一、 樣品準備
1. 準備好 25cm2細胞培養瓶或 60mm細胞培養皿的待測培養細胞(5 X 106細胞)
2. 小心加入 xx 毫升預冷的 SBJ 清理液(試劑 A),覆蓋生長表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞
5. 加入 xx 毫升 SBJ 清理液(試劑 A),混勻細胞
6. 移入到預冷的 15 毫升錐形離心管(注意:懸浮細胞從這一步驟開始)
7. 放進 4℃臺式離心機離心 5 分鐘,速度為 300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入 xx 微升S B J   裂解液(試劑 B),充分混勻
10.轉移到預冷的 1.5 毫升離心管
11.強力渦旋震蕩 15 秒
12.置于冰槽里孵育 30 分鐘
13.放進 4℃微型臺式離心機離心 5 分鐘,速度為 16000g(或 13000RPM)
14.小心移取 500 微升上清液到新的預冷的 1.5 毫升離心管
15.移取 2  微升進行蛋白定量測定
16.即刻放進-70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作
二、細胞活性定磷比色法定量檢測試劑盒測定準備
1. 準備好待測樣品(例如細胞裂解萃取液等),置于冰槽里(注意:樣品須澄清)
2. 設定好分光光度儀(溫度為 30℃):波長為 660nm,并置零
3. 準備好 5 個 1.5 毫升離心管,標記為 1 至 5 號管
4. 按下表分別加入S B J   陰性液(試劑 D)和 SBJ標準液(試劑 H)到每個離心管, 混勻.
5. 將 1 至 5 號管放進冰槽里備用,避免光照;標準管濃度見下表:
管號    SBJ陰性液(試劑 D)    SBJ 標準液(試劑 H)    測定體系標準磷濃度
1                0                  xx 微升                 20 微摩爾/升
2             xx 微升               xx 微升                 15 微摩爾/升
3             xx 微升               xx 微升                 10 微摩爾/升
4             xx 微升               xx 微升                5 微摩爾/升
5             xx 微升                 0                         0

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