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上海谷研實業有限公司

甘油保種的制備以及篩選所需的噬菌體的制備

時間:2015-6-25閱讀:416
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[方法]
1,取10/Il得自實驗方案8.2中步驟6的混合物, 電轉入大腸桿菌的dut+ung+型菌株 (如XLl—B1ue) 中。大文庫容量的文庫可能需要多次電轉化。在我們對泛素系統的研究工作中,我們將文庫電轉入購自Strat agene的XLl—Blue電感受態細胞。可以替換的菌株包括SS320或TGl。

2.將電轉后細胞的適當稀釋液鋪于2TY/Carb/Tet0瓊脂平板中, 以測定轉化株的數量。隨后可以使用平板上的菌落,通過PCR、限制性酶酶切及測序,來檢驗文庫。

3.在250ml的錐形瓶內,將電轉后的菌液(得自步驟1)加入到40m1含有12ul 100mg/ml的羧芐*和20/A1 10mg/ml的四環素的2TY/Glu培養基中。

4.將菌液在37℃振蕩培養至對數生*,直到OD600=0.5,這通常需要4—5個小時。l小時后將12ul 100mg/ml的羧芐*20ul 10mg/ml的四環素①加入到錐形瓶中。

5.取出4m1菌液,加入1.5ml 50%的甘油,每管1m1分裝后于-80℃儲存。

6.將4ml VCSMl3輔助噬菌體(約1010pfu/ml)加入到剩余的菌液中,以使噬菌體與大腸桿菌之比達到10倍左右。將錐形瓶子37℃靜置15~30分鐘。

7.將l/4的菌液(約10ml),分別加入到4個含有100ml 2TY/Glu培養基、75ul 1100mg/ml的羧芐*和100ul 10mg/ml的四環素的250m1錐形瓶中。將錐形瓶于37℃振蕩培養,直到菌液開始輕微變渾(約2小時)。

8.加入70ul 100mg/ml的*,并于37℃振蕩培養過夜。

9.第二天上午,將每份過夜培養的菌液各自分裝入3只Oakridge離心管中,在Sorvall RC 5C plis型離心機中使用SS—34轉子, 于4℃12000 r/min離心15分鐘。

10.從每只離心管中取出30ml上清液,并與7.5ml PEG—NaCl溶液混合,以沉淀噬菌體顆粒。將這些離心管于冰上放置1小時,偶爾混勻液體。

11.如步驟9中所述,于12000r/min離心15分鐘,吸出并棄去上清液。

12.將噬菌體沉淀重懸于PBS中,每管1ml。將重懸后的噬菌體轉移至新的小離心管中,開用小型離心機于10000r/min離心,除去不溶性的殘渣。將干凈的上清液轉移至新的小離心管中并于4℃保存。

英文名稱 Mus musculus (Mouse) 衰老關鍵蛋白2(FBLN2)檢測試劑盒(酶聯免疫吸附試驗法) 規格: 48T/96T
英文名稱 Homo sapiens (Human) 衰老關鍵蛋白2(FBLN2)檢測試劑盒(酶聯免疫吸附試驗法) 規格: 48T/96T
英文名稱 Homo sapiens (Human) 衰老關鍵蛋白1(FBLN1)檢測試劑盒(酶聯免疫吸附試驗法) 規格: 48T/96T
細胞英文名稱 Homo sapiens (Human) 衰變加速因子(DAF)檢測試劑盒(酶聯免疫吸附試驗法) 規格: 48T/96T
英文名稱 Homo sapiens (Human) 輸入蛋白9(IPO9)檢測試劑盒(酶聯免疫吸附試驗法) 規格: 48T/96T

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