N15和C13標(biāo)記重組蛋白的制備

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)學(xué)和蛋白質(zhì)組織代謝學(xué)開始飛速的發(fā)展，特別是近些年NMR（nuclear magnetic resonance）技術(shù)在蛋白結(jié)構(gòu)分析領(lǐng)域逐漸成熟，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析變得簡(jiǎn)單易行。 NMR分析蛋白結(jié)構(gòu)的基本原理是利用核質(zhì)譜儀發(fā)出一系列的電磁波，激發(fā)蛋白中的H、N、C原子，使H、N、C這些原子從基態(tài)轉(zhuǎn)變成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，當(dāng)電磁波發(fā)射完畢后，激發(fā)態(tài)的原子會(huì)自動(dòng)恢復(fù)到基態(tài)，多余的能量就釋放出去，通過(guò)收集這些能量信息，做進(jìn)一步的分析便能得到蛋白的原子結(jié)構(gòu)，畫出蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖。 NMR技術(shù)雖然操作簡(jiǎn)單，但是需要組成蛋白的H、N、C原子具有共振性，H具有天然的共振性可以分析10KD以下的蛋白，常規(guī)蛋白中含有的N14和C12不具有共振性，需要采用他們的同位素來(lái)代替。N15和C13屬于穩(wěn)定同位素不具有放射性，是目前取代常規(guī)蛋白中N14和C12代替物，所以我們?cè)谧龅鞍捉Y(jié)構(gòu)NMR分析過(guò)程中，zui為重要的方面還是在大量 N15和C13標(biāo)記蛋白的獲得。

蛋白質(zhì)獲得的方式有很多種，但是要獲取大量的目標(biāo)蛋白，仍然需要通過(guò)重組蛋白生物合成途徑，一方面容易控制生產(chǎn)條件，另一方面目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量和質(zhì)量能夠得到保障。重組蛋白的生物合成可以選擇原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等，目標(biāo)蛋白需要用N15和C13標(biāo)記，這使得培養(yǎng)細(xì)菌和細(xì)胞的培養(yǎng)基中不能帶入額外的C源和N源。出于對(duì)操作方便性、實(shí)用經(jīng)濟(jì)性、產(chǎn)量高低、技術(shù)難度等多方面考慮，重組蛋白的生物合成以原核表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)為主。原核表達(dá)系統(tǒng)中培養(yǎng)大腸桿菌的培養(yǎng)基常用M9葡萄糖礦物培養(yǎng)基，酵母表達(dá)系統(tǒng)中培養(yǎng)畢赤酵母的培養(yǎng)基常用察氏(czapck)培養(yǎng)基，這兩種培養(yǎng)基C源即用C13的單糖或二糖，N源即用含N15的氯化銨或硝酸鈉等，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，產(chǎn)生的標(biāo)記蛋白易純化。（簡(jiǎn)易步驟如圖所示）