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無乳支原體探針法熒光定量PCR檢測試劑盒實驗規(guī)則及探針法

時間：2021/5/25閱讀：824

1、要保證移液槍的準確性，誤差不能超過2%。可用水和電子天平進行確定。但有專業(yè)人員進行矯正。
2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后，要更換槍頭。即使是吸取標準品時。
3、要在實驗前1小時將試劑盒從冰箱中取出，使各種試劑都恢復(fù)到室溫，以使結(jié)果更穩(wěn)定。
4、實驗時，要使底物避光保存。
5、用槍吸取液體時速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準確。
6、吸取液體時，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差。
7、將液體加到酶標孔中時，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸，液滴會自然流下去。
8、液體全部加完后，可將酶標板在桌子上平行輕輕晃動30秒，混勻液體。也可以用酶標儀的晃動功能。
9、應(yīng)盡量做雙孔實驗，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準確性。
10、對結(jié)果有疑問的樣品要用其它方法進行確證。

探針法：
aqMan 探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增相關(guān)。它與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團連接在探針的5’ 末端，而淬滅劑則在3’ 末端。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5’ 外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。相對于染料法,Taqman探針法具有更高的特異性和準確性

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