在一步法PⅢNP Elisa試劑盒測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象，ELISA試劑盒此時反應后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標準曲線(位于抗體過剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低于實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應(hook effect)，因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時，應注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
其原理為利用酶標記的抗抗體(抗抗體)以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。PⅢNP Elisa試劑盒操作步驟如下：
)將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。
2)加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗 體復合物。經洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。
3)加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，ELISA試劑盒但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗 體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。
4)加底物顯色
本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。ELISA試劑盒間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
間接法成功的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，ELISA試劑盒很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，PⅢNP Elisa試劑盒試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。
