互補(bǔ)DNA（cDNA）克隆基因的表達(dá)是基因分離與鑒定的一個(gè)極為有效的工具。用于篩選的核苷酸探針需要所感興趣基因的原始序列信息，而對(duì)于表達(dá)cDNA文庫(kù)的篩選只需要一個(gè)天然的配體或一個(gè)特異的抗體（單克隆或多克?。┳鳛樘结?。體外篩選入噬菌體或質(zhì)粒展示的cDNA文庫(kù)要將翻譯產(chǎn)物黏附在膜上，這樣優(yōu)于用標(biāo)記探針來(lái)篩選，但這種轉(zhuǎn)移能使cDNA編碼的蛋白變性且危及到檢測(cè)的準(zhǔn)確性。而酵母雙雜交系統(tǒng)*在體內(nèi)操作，重組了一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子并通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)檢測(cè)蛋白與蛋白之間的相互作用?？偟膩?lái)說(shuō)，這些系統(tǒng)難以承擔(dān)大容量文庫(kù)的篩選任務(wù)，于是促進(jìn)了基于選擇而不是篩選的多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)展。由于敏感性和選擇性，通過(guò)反復(fù)富集和特異性相互作用的選擇要比篩選的要求更小。然而，選擇已表達(dá)的克隆，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行cDNA克隆只需要每個(gè)cDNA（為了擴(kuò)增）和它的基因產(chǎn)物（為了檢測(cè)）之間有物理鏈接。為cDNA克隆基因表達(dá)設(shè)計(jì)的*批選擇系統(tǒng)中有一個(gè)系統(tǒng)發(fā)展為用于分離表達(dá)特異細(xì)胞受體的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)化株。zui近以來(lái)，作為從大容量文庫(kù)（≥108克?。┲羞x擇特異的結(jié)合肽或蛋白的強(qiáng)大工具，噬菌體展示技術(shù)的到來(lái)為cDNA克隆基因表達(dá)提供了發(fā)展的機(jī)會(huì)。
1 絲狀噬菌體
因?yàn)槿L(zhǎng)cDNA包括在3’末端的翻譯終止子，原核表達(dá)時(shí)缺乏合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（如果這些cDNA來(lái)源于真核細(xì)胞），確保cDNA在噬菌體表達(dá)的zui實(shí)際的方法是將5’末端與載體基因融合。傳統(tǒng)上，噬菌體展示是與衣殼蛋白pⅢ或pⅧ的N末端融合，并且普遍認(rèn)為直接與任一個(gè)衣殼蛋白的C末端融合都與噬菌體裝配不相容。因此，圍繞這些限制條件設(shè)計(jì)了三個(gè)專門的載體：一個(gè)策略是把pⅢ與c-Jun的*拉鏈融合，而翻譯的cDNA產(chǎn)物與c-Fos（pJufo）的*拉鏈的C末端融合。噬菌體裝配時(shí)，拉鏈結(jié)合在噬菌體的末梢，因此殼體包裹的eDNA與它編碼的產(chǎn)物相連。第二個(gè)策略是直接相互獲取法（Direct Interaction Rescue），利用小衣殼蛋白pⅢ的功能模塊性：eDNA通過(guò)與pⅢ的感染性結(jié)構(gòu)域的C末端融合來(lái)表達(dá)，而蛋白探針?lè)旁趐Ⅲ的C末端部分，包埋在噬菌體的核心。只有那些能在探針和特異的eDNA編碼產(chǎn)物之間建立穩(wěn)定相互作用的噬菌體才能恢復(fù)它們的感染性，同時(shí)用來(lái)在大腸桿菌中擴(kuò)增。第三個(gè)策略（在本章將詳細(xì)描述）是圍繞pⅢ并基于一個(gè)結(jié)論，這個(gè)結(jié)論是小衣殼蛋白pⅥ的C末端表達(dá)在表面，因此一個(gè)富含*的六肽基因Ⅵ（gⅥ）-cDNA的融合基因可以在噬菌體表面顯示。蛋白Ⅵ（pⅥ）通過(guò)在pⅢ和噬菌體核心之間提供鏈接來(lái)穩(wěn)定噬菌體的結(jié)構(gòu)。這三個(gè)系統(tǒng)在蛋白配體和（或）多克隆抗血清選擇文庫(kù)中的eDNA克隆相互作用上被證明是成功的。zui近一團(tuán)體出人意料地報(bào)道了通過(guò)優(yōu)化聯(lián)接序列（8～10個(gè)氨基酸）與pⅢ或pⅧ的C末端融合，多肽能在絲狀噬菌體表面被功能性地展示出來(lái)。理論上，這個(gè)驚人的功能融合應(yīng)該在eDNA克隆基因表達(dá)上起著很重要的作用，但是理論上的證據(jù)仍然需要證明。
2 溶解性噬菌體（lytic bacteriophage）
在絲狀噬菌體系統(tǒng)中，衣殼蛋白先組合成噬菌體顆粒，然后定位在外周胞質(zhì)上。然而這種途徑適應(yīng)于有二硫鍵形成的蛋白（例如分泌蛋白或受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域），但它與在還原環(huán)境下能正常折疊的eDNA編碼產(chǎn)物不相容。事實(shí)上，大多數(shù)噬菌體顆粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)相似，如入噬菌體、T4噬菌體、T7噬菌體，它們都用來(lái)展示編碼細(xì)胞內(nèi)部蛋白的cDNA。在入噬菌體中，已經(jīng)報(bào)道了與衣殼蛋白DEl5]或尾部蛋白VD6]的C末端融合。衣殼蛋白D用來(lái)顯示和選擇cDNA片段，這些片段來(lái)源于丙型肝炎病毒基因組、人腦以及小鼠的胚胎。在T4噬菌體中，衣殼蛋白WAC和SOC的C末端作為蛋白的靶點(diǎn)，用于共價(jià)展示，而T7噬菌體展示系統(tǒng)依賴于衣殼蛋白10A的C末端的溶解性。近年來(lái)，在多個(gè)報(bào)道中都證明了以eDNA選擇為目的的系統(tǒng)具有可用性。利用這個(gè)具有前景的方法制備一個(gè)克隆試劑盒在商業(yè)上是可行的（Novagen）。
會(huì)員1.png)