直到zui近，從噬菌體展示文庫中進(jìn)行的篩選都依賴于被展示蛋白質(zhì)和靶標(biāo)配體之間的結(jié)合。雖然從小分子到核酸及蛋白質(zhì)的各種各樣的靶標(biāo)都已經(jīng)被使用過了，但這些傳統(tǒng)的生物淘選的方法限制了噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用潛力。在這里，我們描述了僅僅基于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性/結(jié)構(gòu)的完整性的、從文庫中篩選蛋白質(zhì)的方法。在查不到蛋白質(zhì)功能的情況下（例如在從頭設(shè)計(jì)或者蛋白組學(xué)中）這種方法可能非常有用。有3個小組提供了對這個問題的不同解決方法：P1Uckthun/Schmid小組、Winter小組和本小組的方法。我們將集中于我們的研究，旨在講解如何從一系列噬菌體展示文庫中篩選出穩(wěn)定折疊的蛋白質(zhì)。
我們將噬菌體展示技術(shù)和蛋白酶解（proteolysis）相結(jié)合，從蛋白質(zhì)—噬菌體混合物和文庫中篩選出穩(wěn)定折疊的變異體。該方法的前提是不穩(wěn)定的和（或）部分折疊的蛋白質(zhì)應(yīng)該比穩(wěn)定折疊的蛋白質(zhì)對蛋白酶的酶切更加敏感，將這與噬菌體展示技術(shù)相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)如后所述的篩選。目標(biāo)蛋白在N端用*標(biāo)簽標(biāo)記，然后在C端與噬菌體少數(shù)衣殼蛋白pⅢ融合后在噬菌粒載體中被表達(dá)出來，形成單價展示。然后展示了融合蛋白的噬菌體通過*標(biāo)簽固定于鎳基質(zhì)上，用蛋白酶處理，在這一步驟中，不穩(wěn)定的蛋白接頭應(yīng)該被切開，因而可以通過簡單的洗滌而除去與它們相連的噬菌體+展示了不怕蛋白酶作用的蛋白質(zhì)的噬菌體，則可以用咪唑或EDTA從基質(zhì)上洗脫下來。然后可以通過照常再次轉(zhuǎn)染大腸桿菌細(xì)胞，擴(kuò)增用這種方法篩選出的噬菌體以用于進(jìn)一步的篩選和（或）DNA序列測定?，F(xiàn)在已經(jīng)知道很多蛋白酶對絲狀噬菌體都不起作用。因而這種方法被專一地用于對展示蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行篩選。
我們實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的蛋白酶篩選方法的原理：
展示了蛋白質(zhì)的噬菌體通過N端的*標(biāo)簽與鎳基質(zhì)結(jié)合（步驟1）；用蛋白酶處理結(jié)合后的噬菌體，展示了對蛋白酶作用敏感的蛋白質(zhì)的噬菌體被從基質(zhì)上切除，并被洗滌下來（步驟2）；然后從鎳基質(zhì)上將展示了蛋白質(zhì)的、能抵抗蛋白酶作用并因此保持與基質(zhì)結(jié)合的噬菌體洗脫下來（步驟3）；將這些噬菌體擴(kuò)增，以供進(jìn)一步的篩選或DNA序列測定（步驟4） 用噬菌體展示進(jìn)行蛋白酶篩選的兩種方法的對比： （a）我們實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的基于親和性的方法；（b）Plackthun/Schmid小組和Winter小組描述的將蛋白質(zhì)的酶解和噬菌體的感染力相結(jié)合的方法
從某種角度來看，這一步驟在原理上與底物噬菌體展示相似，該文庫（這種情況下為線性肽）也被展示在親和性標(biāo)簽和pⅢ之間，從而能固定于固體基質(zhì)上。然而，在這種情況下用特異性蛋白酶進(jìn)行處理是為了鑒定底物特異性，被切割的肽隨后被鑒定為酶的底物。相反，我們設(shè)計(jì)的方法是用來篩選由于折疊而具有抵抗蛋白酶作用的蛋白質(zhì)，盡管它們含有蛋白酶酶切位點(diǎn)。
如前所述，還有另外兩個小組也成功開發(fā)出使用噬菌體展示技術(shù)和蛋白酶解篩選出穩(wěn)定的蛋白質(zhì)的方法。在這些方法中，親和性標(biāo)簽不是必需的，但是被展示蛋白的酶解和噬菌體的感染力（infectivity）是直接相關(guān)的。目標(biāo)蛋白插入到pⅢ蛋白具有感染力的N端結(jié)構(gòu)域（N1、N2）與錨定在噬菌體上的C端結(jié)構(gòu)域之間。因?yàn)镹端結(jié)構(gòu)域是噬菌體感染進(jìn)入大腸桿菌所必需的，如果由于插入的接頭被蛋白酶水解而使得這些結(jié)構(gòu)域被切除，則會導(dǎo)致噬菌體失去感染力。因此，經(jīng)過蛋白酶篩選之后，只有那些展示了能抵抗蛋白酶作用的穩(wěn)定蛋白質(zhì)的噬菌體才能增殖。
Pltiekthun/Schmid小組和Winter小組的方法有一個潛在的缺點(diǎn)：它們與常規(guī)的單價展示無法諧調(diào)。這是因?yàn)樵谡故臼删w上存在著野生型pⅢ蛋白，這會使得它們被篩選及增蘭?而不管pⅢ—融合蛋白是否已經(jīng)被切除，從而造成假陽性。Sieber等人通過另一個噬菌體系統(tǒng)來解決該問題，在該系統(tǒng)中，所有拷貝的pⅢ蛋白都與目標(biāo)蛋白相融合（如多價展示系統(tǒng)）。相反，在篩選中要使噬菌體喪失感染力則要求所有拷貝的被展示蛋白都被酶切。Kristensen和Winter通過構(gòu)建能提供蛋白酶敏感性的pⅢ蛋白的輔助噬菌體巧妙地克服了這個難題。因此，在他們的系統(tǒng)中，展示了的噬菌體顆粒只有當(dāng)pⅢ融合蛋白在能
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