在一個底物噬菌體展示實驗的準備過程中，*步就是要確定用于文庫展示的載體以及如何構建后繼的底物文庫。單價和多價的pⅢ蛋白噬菌體展示體系都可用于底物噬菌體展示。如果采用的是單價展示體系，只有一部分噬菌體顆粒的表面攜帶有單一的底物序列與親和性結構域。這意味著在篩選之前，必須先通過親和性結構域將噬菌體固定在一個固體支持物上。理論上，多價底物噬菌體展示顆粒都包含有超過一個拷貝的親和性結構域和底物，要篩選出某一噬菌體顆粒時，蛋白酶必須對此噬菌體顆粒攜帶的多個底物都進行切割。假設所有的多價噬菌體衣殼蛋白上都同時表達有底物蛋白，那么篩選可以同后續的捕獲親和性結構域這一過程同時在溶液中進行。這使得實驗具有可檢測性；然而，有效的篩選要保證所有未剪切的噬菌體都能通過捕獲與之共表達的親和性結構域而去除。在實際操作中，一些攜帶有缺陷型表位的沒有反應活性（即不能被剪切）的噬菌體克隆可能在此過程中被當作合適的底物篩選出來。同樣的，一群給定的多價噬菌體中也可能包括有許多正在降解中的噬菌體，因此，單個病毒顆粒的效價可能有所變化。同時，多價的噬菌體展示體系也需要一個全長的、未剪切過的pⅢ蛋白來實現感染。如果經過剪切的噬菌體比未剪切的噬菌體有更高的感染活性，那么這一條件可以作為選擇性的優勢來篩選出酶的真正底物。然而，即使在沒有蛋白酶切割的情況下，文庫中的某些序列也可能具有較高的感染活性，因而使得初始的文庫分布和隨后的篩選過程帶有偏差。
盡管存在以上的限制，單價和多價的噬菌體展示系統都已被成功地應用于確定許多蛋白酶的底物。在這一章中，我們將把注意力集中在pⅢ噬菌粒/單價展示系統，盡管這種單價展示系統中的許多特點和多價展示系統一致。底物噬菌粒展示中zui典型的一個載體，具有以下幾個重要的特征：
①由親和性結構域基因、編碼底物序列和M13基因Ⅲ三個部分組成的融合蛋白基因；
②用于大腸桿菌中融合蛋白組成性表達的啟動子序列；
③細菌及f1復制起始位點，加上一個抗生素抗性基因。
在第1章和第4章中可以找到更多關于噬菌體展示載體的細節描述。這里，我們將注意力集中于底物噬菌體展示應用相關的載體設計。
1 相互結合位點的選擇
在蛋白酶底物噬菌體展示中，一個關鍵的組分是親和性結構域，它使我們可以將底物序列和非底物序列區分開。這其中包括蛋白—蛋白相互作用、蛋白—肽段相互作用以及多*與鎳螯合基質的結合。整合這幾種不同的系統的要素在于，展示系統是基于高親和性相互作用而設計的。通常，相互結合的兩個物質之間的解離常數（Kd）應該至少在一個較低的nmol/L的數量級上，這樣在實驗中復合物的解離速度就可以比蛋白酶解的速度慢得多。例如，我們以往在這個領域中的工作中，利用的是一個hGH的高親和性變異體，此變異體與其受體的Kd值約13pmol/L。然而，對于蛋白酶底物噬菌體展示庫，挑選在適當的緩沖液條件下（例如低pH或高pH）能夠被破壞的這種相互作用，將有助于選擇性地富集非底物序列（被捕獲而結合于固體支持物上）和*的底物序列（被蛋白酶解而釋放）。另外一個必須考慮的是靶蛋白酶（或者其他的一些噬菌粒形成中可能碰到的蛋白酶）必須不會酶切親和性結構域。由于這個原因，親和性結構域一般都是一個穩定的球蛋白或者一個短的肽段。
2 底物卡匣（cassette）的設計和構建
底物噬菌體展示要成功，一個關鍵在于切割僅僅發生在親和性（捕獲）結構域和噬菌粒之間。幸運的是，絲狀噬菌體對蛋白酶解有*的抗性：在所有已知的蛋白酶中，只有枯草桿菌蛋白酶能夠引起噬菌體外膜蛋白的顯著降解。為使底物序列更易與蛋白酶作用，在附近的連接序列中引入一定部分柔韌性（segmental flexibility）的設計要謹慎。例如，底物序列GPGG（X）。GGPG位于親和性結構域和pⅢ基因之間，柔韌的*—*接頭分布于隨機序列的兩端。在我們的實驗中，已經證實截短形式的pⅢ蛋白是有效的，但另外也有報道使用全長pⅢ蛋白也能取得成功。在多價底物噬菌體展示中，一個全長pⅢ蛋白對于感染是必需的。
一些其他的重要因素也主導著文庫卡匣的設計，包括隨機化的密碼子、密碼子的選擇以及文庫的大小，這些在第2章中有詳細的描述。在許多情況下，我們不可能窮盡含有8個或8個以上的殘基的整個底物序列所有可能的排列。然而，在文庫僅展示了一部分可得到的序列的情況下，我們也有可能得到關于底物特異性的相關信息。例如，要構建一個包含5個密碼子的隨機文庫，可以先列舉其中2個密碼子的序列，以此作為參照序列；從中得到的信息可用于第二次的文庫構建，即將此兩個密碼子固定，再列舉另外3個密碼子和（或）其他的擴展的底物序列。作為替代，可以通過整合已知的特異性決定因素并查明那些現在還較不清楚的因素，從頭設計一個更集中的文庫。
