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上海酶聯(lián)生物研究所
上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：1622發(fā)布時間：2010-4-17
目前，纖維素是zui豐富的可再生有機(jī)資源，其生物降解主要由微生物——細(xì)菌和真菌完成。細(xì)菌主要產(chǎn)中性纖維素酶和堿性纖維素酶，這類酶制劑對天然纖維素的水解作用較弱，長期以來沒有得到足夠的重視。但原核生物的基因一般不含內(nèi)含子，可直接從基因組DNA中克隆到目的基因用于工程菌的構(gòu)建。因此細(xì)菌纖維素酶基因的克隆，既利于研究纖維素酶基因的多樣性，也利于纖維素酶基因工程菌的構(gòu)建。隨著中性纖維素酶和堿性纖維素酶在棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業(yè)中的成功應(yīng)用，以及耐熱性纖維素酶在燃料酒精生產(chǎn)中應(yīng)用，細(xì)菌纖維素酶制劑已顯示出良好的應(yīng)用性能和巨大的經(jīng)濟(jì)價值。
2 纖維素分解性細(xì)菌的類群
纖維素分解性細(xì)菌是指能分解纖維素的細(xì)菌，分三大類群：（1）厭氧發(fā)酵型：芽孢梭菌屬（Clostridium）、牛黃瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、白色瘤胃球菌（Ruminococcusalbus）、產(chǎn)琥珀酸擬桿菌（Bacteroidessuccinogenes）、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobactersuccinogenes）、溶纖維菌（Butyrivibriofibrisolvens）、熱纖梭菌（Clostridiumthermocellum）、解纖維梭菌（Clostridiumcellulolyticum）；（2）好氧型：糞堿纖維單胞菌（Cellulomonasfimi）、纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）、發(fā)酵單胞菌（Zymomonas）、混合纖維弧菌（Cellvibrimixtus）；（3）好氧滑動菌，如噬胞菌屬（Cytophaga）。
3 細(xì)菌纖維素酶基因的克隆與表達(dá)
細(xì)菌中編碼纖維素酶的基因在基因組的分布為隨機(jī)的或形成基因簇。在基因簇中，有轉(zhuǎn)錄終止子，沒發(fā)現(xiàn)有啟動子。人們已從40多種細(xì)菌中克隆到了纖維素酶基因，其中一些酶基因已經(jīng)在大腸桿菌和酵母中得到表達(dá)。如從Stropyomyces、Clostridium、Thermoanaerobacter、Themomonspora、Erwinia、Pseudomonas、Cellvibrio、Ruminococcus、Cellulomonas、Fibrobacter和Bacillus中成功分離出葡聚糖基因，并先后克隆了瘤胃的Bacteroides、succi nogenes、ButyrivibriospRuminococcusalbus等細(xì)菌的纖維素酶基因，同時熱梭菌中的11種內(nèi)切纖維素酶（CelA、CelB、CelD、CelE、CelF、CelG、CelH、CelI、CelJ、CelK、CelS）的基因已經(jīng)被克隆，嗜纖維梭菌的5種內(nèi)切纖維素酶（EngA、EngB、EngC、EngD、EngE）已經(jīng)測序并在大腸桿菌中得到表達(dá)。楊智源、劉永生、游銀偉等從不同的細(xì)菌中克隆了內(nèi)切葡聚糖酶基因[1-3]。Kim等克隆了AquifexaeolicusVF5編碼EG的ce18Y基因，在E.coliXL1-Blue中成功表達(dá)，Hakamada等運用盒式連接介導(dǎo)PCR和反向PCR克隆到了基因egl-257。人們將纖維素酶、纖維二糖等外源基因轉(zhuǎn)入運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonasmobilis）中并得到不同程度的表達(dá)，有望將它改造為能將纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇的重組菌株并在工業(yè)中廣泛應(yīng)用。細(xì)菌葡聚糖酶基因在S.cerevisiae的啟動子和信號肽的控制下構(gòu)建在同一質(zhì)粒載體上，然后轉(zhuǎn)入S.cerevisiae，重組菌可向培養(yǎng)基分泌保留70%活性的葡聚糖內(nèi)切酶和外切酶，這種酶能夠分解濾紙和木漿中的纖維素。
4 細(xì)菌纖維素酶分類
細(xì)菌纖維素酶是多酶復(fù)合體系，根據(jù)各酶的功能可分為三大類：（1）內(nèi)切葡聚糖酶（1,4-D-glueanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），簡稱Cen。作用于纖維素內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1,4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產(chǎn)生大量非還原性末端的小分子纖維素，其分子量大小約為23-146KD。（2）外切葡聚糖纖維二糖水解酶（1,4-β-D-glucancellobio-hydrolase或exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），簡稱Cex。作用于纖維素線狀分子末端，水解β-1，4-D-14糖苷鍵，依次切下一個纖維二糖分子，故又稱為纖維二糖水解酶（cellobiohydrolase），分子量約38-118KD。（3）β-葡萄糖苷酶（β-1,4-glucosidase,EC3.2.1.21）簡稱BG或稱纖維二糖酶。這類酶一般將纖維二糖或可溶性的纖維糊精水解成葡萄糖分子，其分子量約為76KD。
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