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上海酶聯生物研究所
上海酶聯生物研究所
閱讀：524發布時間：2011-10-14
1.挑取適當菌株的E.coli 單菌落接種于2ml SOB培養液中，37℃搖床過夜。
2.取0.5-1ml過夜培養的菌液轉種到50ml SOB中，18℃劇烈震蕩，直到A600達到0.6。
3.將培養物轉移到50ml離心管中，4℃ 4,000rpm/min離心10min。同時在冰浴上配置TB溶液。
4.棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養液被吸干。
5.取1ml剛配的TB溶液打散菌體沉淀，再加入15ml TB（1/3體積的起始培養液），冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min離心10min。
6.棄上清，沉淀重懸于4ml TB（1/12.5體積的起始培養液），冰浴10min。
7.加入280μl DMSO，緩緩滴入并輕輕搖晃，使其充分混合均勻，冰浴10min。
8.將菌液分裝于EP管中，-80℃或液氮凍存。
9. 取兩管感受態細胞分別加入1μl無菌ddH2O（陰性對照）和1μl純質粒（陽性對照）進行轉化（見后），以檢測感受態的質量。陰性對照平板上應該無菌落生長，陽性對照平板上菌落數目的多少顯示感受態效率的高低。
SOB的配制：
蛋白胨 20g
酵母提取物 5g
NaCl 0.58g
KCl 0.186g
100×Mg++溶液 10ml
溶解并加水定容至1L，121℃×20min高壓蒸汽滅菌
100×Mg++溶液：
MgCl2﹒6H2O
MgSO4﹒7H2O
溶解并加水定容至100ml，121℃×20min高壓蒸汽滅菌
TB溶液的配制：
1M KCl 5ml
0.55M MnCl2 2ml
0.5M CaCl2 0.6ml
0.1M K-Pipes（pH 6.7） 2ml
ddH2O 10.4ml
Total 20ml
注：上述溶液均需高壓蒸汽滅菌處理
0.1M K-Pipes（pH=6.7）的配制：
稱取3.02g Pipes粉末溶于80ml dd H2O中，此時粉末不能*溶解，用10N KOH或KOH固體調節PH值，只有當PH接近6.7時粉末才能*溶解，此時當小心少量地加入KOH直至達到所需PH值。
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