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上海酶聯(lián)生物研究所
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上海酶聯(lián)生物研究所
閱讀：361發(fā)布時間：2012-2-13
1)細(xì)胞制備
1．培養(yǎng)5ml酵母至對數(shù)生長早期(106～107細(xì)胞/ml)。
2．直接加1/10體積的甲醛到培養(yǎng)基里固定細(xì)胞(加入的甲醛終濃度為3.7％，標(biāo)準(zhǔn)母液是37％)。
3．細(xì)胞在甲醛中培養(yǎng)至少1小時。
4．離心收集細(xì)胞，用0.1mol/L磷酸鉀(pH7.5)洗一次。
5．把細(xì)胞懸浮在1ml的50mg/ml消解酶100T或50單位/ml的溶細(xì)胞酶[溶于含有2ml/ml 6-巰基乙醇的0.1mol/L的磷酸鉀溶液中]。
6．置30℃培養(yǎng)30分鐘，用相差顯微鏡檢查原生質(zhì)的生成率。細(xì)胞應(yīng)呈黑色或半透明灰色，亮細(xì)胞(折射體)屬于沒有充分被消化的。菌蛻屬消化過夜。
7．離心收集細(xì)胞，懸浮在1ml的PBS中。
2)染色
1．取10ml的1mg/ml聚賴氨酸，放到用特氟隆封閉的(Teflonmasked slides)載玻片(10孔載玻片)上的每個孔，再用蒸餾水洗載玻片，干燥。
2．放10ml固化細(xì)胞到每個孔中，幾分鐘后，用PBS抽洗3次。用顯微鏡檢測載玻片確保呈合適的密度而不聚集。
3．該步驟可任選(本實(shí)驗不需要使用抗體，但建議使用)：把載玻片浸泡在冷甲醇(－20℃)6分鐘后，然后放到冷丙酮(－20℃)30秒，該處生理產(chǎn)生扁平細(xì)胞，有助于細(xì)胞骨架的觀察。對于一些抗體-抗原結(jié)合物，需要這些步驟重新活化，用PBS重新潤濕玻孔。
4．加15ml由PBS＋3％BSA(牛血清白蛋白)組成的阻斷緩沖液到玻孔中。在保濕盒子中，如墊有濕紙巾的平板中保溫30分鐘。重要的是，在這期間不能讓載玻片孔干透(BSA可通過阻斷蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)降低非特異抗體結(jié)合到載玻片)。</P< p>
5．吸出阻斷緩沖液，用PBS＋3％BSA洗兩次。
6．加10～15ml*抗體(溶解在PBS＋3％BSA)到載玻片孔中，在一個保濕盒中保溫1小時。用親和純化抗體或單克隆抗體，如果可能，用缺乏目的抗原的同源對照。作一個沒有*抗體的對照也是有幫助的。
7．吸出*抗體，用PBS＋3％BSA洗3次。
8．用熒光第二抗體重復(fù)第6～7步(在暗處培養(yǎng))。
9．吸出第二抗體，用PBS＋3％BSA洗3次。
10． 加10～15ml的1μg/ml DAPI到載玻片孔中，培養(yǎng)約1分鐘，用PBS洗3次。
11． 吸出PBS，給每個孔加一小滴封固劑，放蓋玻片，避免在孔中出現(xiàn)氣泡。用紙巾除去多余的封固劑，小心不要移動蓋玻片，用干凈的指甲油密封，－20℃下保存。
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