DNA重組技術(shù)的操作步驟

一個典型的DNA重組包括五個步驟： 　　（1）目的基因的獲取 　　目前，獲取目的基因的方法主要有三種：反向轉(zhuǎn)錄法、從細(xì)胞基因組直接分離法和人工合成法。 　　反向轉(zhuǎn)錄法是利用mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得目的基因的方法。從細(xì)胞基因組中直接分離目的基因常用"鳥槍法"，因?yàn)檫@種方法猶如用散彈打鳥,所以又稱"散彈槍法"。用"鳥槍法"分離目的基因，具有簡單、方便和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。許多病毒和原核生物、一些真核生物的基因，都用這種方法獲得了成功的分離。 化學(xué)合成目的基因是20世紀(jì)70年代以來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)。應(yīng)用化學(xué)合成法，可在短時間內(nèi)合成目的基因。科學(xué)家們已相繼合成了人的生長激素釋放抑制素、胰島素、干擾素等蛋白質(zhì)的編碼基因。 （2）DNA分子的體外重組 　　體外重組是把載體與目的基因進(jìn)行連接。例如，以質(zhì)粒作為載體時，首先要選擇出合適的限制性內(nèi)切酶，對目的基因和載體進(jìn)行切割，再以DNA連接酶使切口兩端的脫氧核苷酸連接，于是目的基因被鑲嵌進(jìn)質(zhì)粒DNA，重組形成了一個新的環(huán)狀DNA分子（雜種DNA分子）。 （3）DNA重組體的導(dǎo)入 把目的基因裝在載體上后，就需要把它引入到受體細(xì)胞中。導(dǎo)入的方式有多種，主要包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射、微粒轟擊和電擊穿孔等方式。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)主要適用于細(xì)菌一類的原核生物細(xì)胞和酵母這樣的低等真核生物細(xì)胞，其他方式主要應(yīng)用于高等動植物的細(xì)胞。 （4）受體細(xì)胞的篩選 由于DNA重組體的轉(zhuǎn)化成功率不是太高，因而，需要在眾多的細(xì)胞中把成功轉(zhuǎn)入DNA重組體的細(xì)胞挑選出來。應(yīng)事先找到特定的標(biāo)志，證明導(dǎo)入是否成功。（5）基因表達(dá) 目的基因在成功導(dǎo)入受體細(xì)胞后，它所攜帶的遺傳信息必須要通過合成新的蛋白質(zhì)才能表現(xiàn)出來，從而改變受體細(xì)胞的遺傳性狀。目的基因在受體細(xì)胞中要表達(dá)，需要滿足一些條件。例如，目的基因是利用受體細(xì)胞的核糖體來合成蛋白質(zhì)，因此目的基因上必須含有能啟動受體細(xì)胞核糖體工作的功能片段。