目前IHC方法可用許多的方法進行檢測，如ABC法、S-P法、CSA法、EnVision法等。可用于標記的酶有HRP、AKP和葡萄糖氧化酶等。zui后可通過酶促反應使其在抗原抗體結合部位轉化為一定顏色的可見沉積物，對抗原進行定位、定量分析。這些轉化物可根據(jù)底物不同，產(chǎn)生不同的顏色，如NBT／BCIP為紫藍色，AEC／H202為紅色，DAB／H202為棕褐色等。而另一種酶促反應可產(chǎn)生一種能在一定波長光照射下生成各種明亮熒光，使IHC敏感性大大提高。Larison等（1995）較早報道了熒光發(fā)生素—磷酸酶底物（fluorogenic Phosphate sesubstrate）方法，用于IHC的信號檢測放大。該方法將標記在抗體上的堿磷酸催化酶底物，轉化成能產(chǎn)生熒光的基團分子。Larison所用磷酸酶底物為2—（5，—氯—2，—羥苯基）—6—氯—4（3H）—喹吡啉，也稱ELF-97磷酸鹽底物，并檢測冰凍切片——石斑魚視黃醛組織內(nèi)的多種抗原成分。其操作流程如下。

（1）常規(guī)石斑魚視黃醛組織冰凍切片16t~m厚，經(jīng)固定，PBS洗。

（2）浸入阻斷液內(nèi)洗30min（阻斷液：30mmol／L Tris鹽、150mmol／L NaCl、1%BSA、0．5％TritonX-IOO，pH7．5）。

（3）滴加適當稀釋特異性一抗，37~C，1h，PBS洗3X3min。

（4）生物素化二抗，37~C，30min，PBS洗3X3min。

（5）鏈霉親和素—AKP，37~C，30min，PBS洗3X3min。

（6）熒光信號轉化：將切片浸入ELF磷酸鹽底物液[ELF磷酸鹽底物液：將3t~mol／L2—（5，—氯—2，—羥苯基）—6—氯—4（3玎）—喹吡啉加入至底物緩沖液（底物緩沖液：10mmol／LTris、200mmol／LNaCl、lmmol／lMgCl、0．1mmol／lZnCl2和0．1％二甲亞砜）內(nèi)]，反應8～12s，快速除去反應底物，用阻斷緩沖液（阻斷緩沖液：150mmol／LTris、lOOmmol／LED—TA、lmmol／L左旋咪唑、0．05％TritonX—100，pH8．0）洗20min，中止反應。

（7）用0．125~mol／LHoechst33342襯染3min，PBS洗，無水甘油封片。熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)波長為360nm；發(fā)射波長為540nm）。

在熒光顯微鏡下可見ELF底物產(chǎn)生明亮的黃綠色熒光，沉積在抗原抗體結合部位。Larison等的結果表明，ELF技術在IHC中的應具有以下特點。

（1）克服組織標本的自發(fā)熒光。ELF—97乙醇沉積物具有180nm以上的Stokes移位，對于組織細胞內(nèi)的自發(fā)熒光位移小的特點，可以有效克服這種缺點。另外，ELF沉積物的熒光信號強度和持續(xù)發(fā)光時間要較其他標記二抗的熒光發(fā)光高500倍，也可以有效地避開自發(fā)熒光的影響。

（2）具有較好的穩(wěn)定性。ELF-97磷酸鹽染色的固定標本可保存數(shù)月或數(shù)年，很少出現(xiàn)熒光信號的損失。

（3）可用于免疫熒光組織化學的多重標記。ELF產(chǎn)生的亮綠色熒光可與紅色熒光（如Texared、羅丹明、藻紅蛋白）或藍色熒光（例如Hoechst、AMCA和Cascade blue）結合進行多重標記。

（4）另外，目前分子探針公司已開發(fā)了多種ELF免疫組織化學染色試劑盒和細胞學標記試劑盒。商品化試劑盒提供了一種快速、敏感的檢測組織細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和mRNA的方法。