重要的是對稀釋的稱重校正以及比對一級標準對二級標準的許多稀釋度的測定，要求覆蓋整個范圍呈線性，并且回歸要通過零點，根據回歸線的斜率定值。血清蛋白和載脂蛋白的標準晶（或參比材料）與大多數其他非純化蛋白的以血清為基礎的標準品不一樣，因此，其可被直接用于對zui終校準品的定值。因為標準品以血清為基礎，所以基質效應上的差異基本上可以排除。
對于激素和腫瘤標志物來說，一級和二級標準品通常稀釋于人工含蛋白的緩沖液中，對所有復溶和稀釋都應進行稱重校正，并根據不同稀釋度的回歸線的斜率定值。復溶后，一級和校準的二級標準品應分裝成小包裝，密封于玻璃安瓿中一70℃下保存。二級標準品通常用低蛋白含量（例如0．5％～1．0％的清蛋白）的緩沖液制備，但校準品應以血清為基質或用蛋白含量類似于血清的緩沖液制備。這一點對用來傳遞值的測定方法有較嚴格的要求，即其基本不受基質不同的影響。可通過測定稀釋于零校準晶中的樣本來確證沒有基質效應。理想情況下，應使用參考方法來進行值的傳遞，但對于多肽激素和腫瘤標志物來說尚無此類方法。用于校準品制備的無內源性激素的基質，可使用已去掉激素的病人血清?？赏ㄟ^使用特異抗體的免疫吸附方法將多肽激素從血清中去除，但這種方法常會少量抗體在血清中，這種抗體對相應的免疫測定方法會有所干擾。有時也使用動物血清或人工蛋白緩沖液作為制備基質，這些基質各有其優缺點。人血清是zui自然的基質，但較難大量得到，使得每批標準品的量有限，需頻繁更換，每批之間總會有微小差異。動物血清雖可大量得到，但其整體上的特性與人血清是不一樣的，并且動物激素與人激素可能會有交叉反應。蛋白緩沖液則缺乏正常血清中所具有的大部分干擾物質，如果樣本體積相對總的測定體積較小（10％～15％）的話，這些影響通?？梢院雎圆挥?。
對于類固醇激素來說，由于結合蛋白的干擾，對結合蛋白的激素的直接測定的校準較為復雜。因為結合蛋白的親和力與所使用的測定抗體相類似，所以在測定中必須使用分離物質以替代離開結合蛋白的激素，很難在不干擾抗體結合的情況下*排除結合蛋白的影響。因此，要有以血清為基礎的校準品。無類固醇的血清可通過木炭吸附的方式制備，可將溶解在乙醇中的純類固醇加入至去除內源性類固醇的血清中制備校準品，但仍發現有異常結合蛋白可引起較大的偏差，如具有高性激素結合球蛋白（SHBG）的樣本用于睪酮直接測定時結果偏低，但SHBG稍有異常的樣本，則測定結果偏高。除了結合蛋白，所有影響其他免疫測定的非特異因素也影響類固醇和甲狀腺激素的測定。為改善方法的測定下限，樣本在總的測定體積中的比例很高，因此，存在于樣本中的非特異因素是測定誤差的重要來源。對類固醇激素提取方法的校準非常簡單，標準品可得到商品純品，將其稱量后溶于有機溶劑（通常為乙醇）可制備校準品貯備液，類固醇的含量可采用光電比色確認。稀釋貯備液即可得到校準晶應用液。
標準品定值的測定方法可使用參考方法。定義方法（definitivemethod）是一個具有高精密度及沒有系統偏差的參考方法。放射性核素稀釋質量分光光度法（isotope dilution-mass spectrometry，ID-MS）可作為類固醇激素和其他一些小分子測定的定義方法，但這種方法極為昂貴因此難于大規模使用。用于蛋白測定的質量分光光度法雖在快速發展，但仍無合適的方法用于復雜生物學樣本中低濃度多肽的定量測定。當沒有定義方法可使用時，則可確定一個參考方法，例如有人提出了載脂蛋白B的參考方法。hCG測定標準化工作組推薦了可用于不同hCG變異體測定的參考方法。這種參考方法應有低測下限、不受非特異干擾及不與相關的化合物發生交叉反應，同時還應該容易得到。盡管所有關鍵試劑都相同，但在測定具體設計上的差異仍會引起偏倚，因此，有必要建立一個參考實驗室的網絡，以保持參考方法的有效性。
