膠體金對蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質的等電點或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質的等電點時，則會聚集而失去結合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強度、蛋白質的分子量等都影響膠體金與蛋白質的結合。
1．待標記蛋白溶液的制備 將待標記蛋白預先對0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4℃離心1h，去除聚合物。
2．待標膠體金溶液的準備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調膠體金液的pH值。標記IgG時，調至9.0；標記McAb時,調至8.2；標記親和層析抗體時，調至7.6；標記SPA時，調至5.9～6.2；標記ConA時，調至8.0；標記親和素時，調至9～10。由于膠體金溶液可能損壞pH計的電板，因此，在調節pH時，采用精密pH試紙測定為宜。
3．膠體金與標記蛋白用量之比的確定
（1）根據待標記蛋白的要求，將膠體金調好pH之后，分裝10管，每管1ml。
（2）將標記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5µg/ml～50µg/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對照管只加1ml稀釋液。
（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結果。
（4）結果觀察，對照管（未加蛋白質）和加入蛋白質的量不足以穩定膠體金的各管，均呈現出由紅變藍的聚沉現象；而加入蛋白量達到或超過zui低穩定量的各管仍保持紅色不變。以穩定1ml膠體金溶液紅色不變的zui低蛋白質用量，即為該標記蛋白質的zui低用量，在實際工作中，可適當增加10％～20％。
4．膠體金與蛋白質（IgG）的結合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續攪拌10min，加入一定量的穩定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發生沉淀。常用穩定劑是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液終濃度為1％；1％聚乙二醇加至總溶液的1／10。
