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質體的轉形與重組質體的檢定

時間:2015/7/1閱讀:256
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    細菌質體需藉由轉形 (transformation) 的技術,將的引介入細菌體中,藉由寄主細菌的系統達成復制或進基因表現的目的。寄主細菌的選擇,須視質體的種類及實驗的目的而定。本實驗的目的在建構一個表現質體,使的能在大腸桿菌中大表現 GUS。蛋白

    然而,用大腸桿菌進外源基因的表現時,常遇到的問題是,外源基因的產物會對寄主細菌造成傷害;此外,持續斷的表現外源基因也會使寄主細菌生長減慢或無法生長。因此,必須有適當的調控機制控制外源基因的表現。 我們所用的載體pQE31 在T5 promoter與外源基因插入地址的間,具有一段lac operon中的lacO序,蛋白可用lac repressor結合其上調控T5 promoter的啟動,只有在inducer (如IPTG) 加入時,才會啟動轉錄的進,而lac repressor的源則必須靠寄主提供。

    由于此質體為multiple copies,一般大腸桿菌菌株中lac repressor的含足以有效地進調控,縱使未加入inducer,也會有外源蛋白質的表現,萬一外源蛋白質對寄主造成毒害,使的無法生長,我們可能表現質體無法選殖到,無法達成我們的實驗目的。 我們所選用的寄主菌株JM109 所具有的 lacIq,能夠過表現 (overproduce) lac repressor,因此可較有效地控制T5 promoter的啟動。 然而,是JM109 這一類帶有lacIq的菌株發生問題時,就必須再換其它的寄主菌株;如M15[pREP4],此菌株除染色體上的lacI基因外,還帶有能持續表現lacrepressor的質體,應可解決lac repressor 足的問題。

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