在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA試劑盒中似不恰當。ELISA試劑盒屬固相，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。
以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。
洗滌：
洗滌在ELISA試劑盒過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELISA試劑盒就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。
聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA試劑盒操作中，洗滌是zui主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。洗滌的方式除某些ELISA試劑盒儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種顯色和比色 。
