當(dāng)培養(yǎng)吼或培養(yǎng)瓶內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞形成致密的單層時(shí)，應(yīng)進(jìn)行傳代，否則對細(xì)胞生長不利。步驟如下：

1．洗滌細(xì)胞PBS洗滌細(xì)胞2次。

2．消化細(xì)胞加入O．05％*溶液1ml消化單層細(xì)胞，鏡下可見細(xì)胞立即變圓、收縮。棄去*，利用培養(yǎng)瓶內(nèi)殘余*進(jìn)行消化。當(dāng)觀察到大部分細(xì)胞脫落或漂浮起來時(shí)加入培養(yǎng)液，終止*的消化作用。

3．培養(yǎng)細(xì)胞用滴管吹打壁上的細(xì)胞，使其*脫離和分離。按l：2的比例接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

一、結(jié)果分析

通過培養(yǎng)可獲得生長良好的內(nèi)皮細(xì)胞，可用下述方法對其進(jìn)行鑒定。

1．光鏡觀察倒置相差顯微鏡下可見內(nèi)皮細(xì)胞呈菱形或多角形，融合成片后可形成鵝卵石狀鑲嵌排列。

2．電鏡觀察剛貼壁的內(nèi)皮細(xì)胞呈長多角形，并向四周伸向細(xì)長的突起，融合成片后細(xì)胞呈多角形。細(xì)胞表面有微絨毛，也有的細(xì)胞質(zhì)膜凹陷。胞核呈橢圓形，個(gè)別稍凹陷·核仁明顯。細(xì)胞之間具有間隙，伸出突起相連。位于邊緣的細(xì)胞呈收縮狀態(tài)，胞體*微絨毛收縮成小泡狀。

3．因子Ⅷ相關(guān)抗原免疫熒光檢測  由于因子Ⅷ只存在于內(nèi)皮細(xì)胞、巨核細(xì)胞和血小板中，故因子Ⅷ相關(guān)抗原是鑒定體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞zui可靠的標(biāo)志。操作步驟如下：

(1)固定內(nèi)皮細(xì)胞：內(nèi)皮細(xì)胞用PBS沖洗干凈，放人乙醇一丙酮混合液(1：1)中固定10min，在空氣中自然干燥。

(2)加入抗體：加入因子Ⅷ相關(guān)抗原抗血清(如兔抗人因子Ⅷ相關(guān)抗原抗血清)，37℃孵育lh。用PBS沖洗干凈，晾干，再加抗*動(dòng)物IgG熒光抗體(如羊抗兔IgG熒光抗體)，37℃孵育30min。PBS沖洗，晾干。

(3)封片：用緩沖甘油封片。

(4)觀察：將片子置熒光顯微鏡下觀察，內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)呈較強(qiáng)的黃綠色熒光，胞核周圍尤其明顯。

 二、細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

 (一)細(xì)胞凍存

內(nèi)皮細(xì)胞生長到一定數(shù)量時(shí)可用液氮凍存?zhèn)溆谩２襟E如下：

1．洗滌細(xì)胞  在*消化下來的細(xì)胞中加入少量培養(yǎng)液，離心(1000r／min，10min)，吸去上清液。

2．凍存細(xì)胞向洗滌過的細(xì)胞內(nèi)加入凍存液(含10％DMSO的培養(yǎng)液)，使細(xì)胞濃度約為l×106／ml。將其分裝于細(xì)胞凍存管中，每管1ml。把凍存管放至70℃冰箱中過夜，再將凍存管放入液氮中凍存。

(二)細(xì)胞復(fù)蘇

1．融化凍存的細(xì)胞從液氮中取出凍存管，迅速放入37℃水浴中并不斷振搖，使其快速融化：

2．洗滌細(xì)胞將凍存管離心(1000r／min，10min)，吸去上清液，以去除DMSO。

3．培養(yǎng)細(xì)胞向凍存管內(nèi)加入1ml培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞沉淀以獲得細(xì)胞懸液，移人培養(yǎng)瓶內(nèi)，再加入．4ml培養(yǎng)液，使細(xì)胞濃度為3×lO5／ml。