1. 控制

在 為了區(qū)分樣品的特定和非特異性條帶 材料，始終對每個印跡運行對照，其中只有二次 應用不含一抗的抗體偶聯(lián)物。

2.二抗稀釋

這 二抗不應在過高濃度下使用。在 大多數(shù)應用中二抗可以很好地用于稀釋 高于 1：10.00，而較高濃度可能有利于非特異性 后臺綁定。作為指導原則，與彩色承印物相比 當ECL底物 使用。最佳稀釋度也可能因不同批次的 二抗。

Western blotting的推薦稀釋度：

 • HRPO conjugates：1:5.000 – 1:100.000 (non-ECL) / 1:10.000 – 1:200.000 (ECL)

• Alk. Phos. conjugates：1:5.000 – 1:50.000

• Biotin conjugates：1:20.000 – 1:400.000

 • Streptavidin-HRPO：0,01 – 0,1 µg/ml

•  Streptavidin-Alk.Phos：1 – 2 µg/ml

3.使用牛奶粉時的注意事項

牛 奶粉經(jīng)常用作Western blotting中的封閉劑， 但有時它也可能是不需要的背景的來源。在 為了減少二抗的背景反應 牛Ig在奶粉中利用二抗吸附 對牛（MinX Bo）或人類（MinX Hu）Ig/血清蛋白是 推薦。

減少非特異性背景的其他措施包括用來自與二抗相同物種的 5% 正常血清或不含 IgG 的 BSA（貨號 001-000-161 / 2）進行封閉。通常，改用正常血清作為封閉試劑可有效獲得最干凈的印跡結果。

一般來說，次要的 抗體應在不含蛋白質堿（如牛奶）的緩沖液中稀釋 粉末A.O.為了排除二抗與 蛋白質補充劑中存在的免疫球蛋白或蛋白質。這是 對于抗山羊偶聯(lián)物尤其重要（見4）。

4. 使用抗山羊偶聯(lián)物時的注意事項

防山羊 來自宿主物種驢、兔和小鼠的二抗 與牛免疫球蛋白高度交叉反應，例如牛奶中的免疫球蛋白 粉。如果二抗稀釋緩沖液含有奶粉， 幾乎所有的反山羊偶聯(lián)物都會被牛Ig吸附。 這會導致信號Wan全缺失或信號微弱，如果 共軛物以高濃度施用。此外，這些 如果牛奶粉 用于阻止。

為了檢測蛋白質印跡上的山羊一抗，我們建議使用牛抗山羊（貨號805-xx5-180）。在非常密切相關的宿主牛中產生抗山羊抗血清導致抗體與牛Ig /血清蛋白沒有交叉反應性。

5. 樣品裂解物中的內源性免疫球蛋白

如果 由SDS-PAGE分離的樣品材料是 含免疫球蛋白的細胞或組織，無二抗 與樣品相同的物質的交叉反應（MinX）應該是 使用。（或者，正常血清（Ig）的相同物種比 樣品材料可以添加到二抗稀釋緩沖液中。

6. 免疫沉淀后抗體的背景條帶

在 下面的文章你可以閱讀背景波段是如何引起的 使用時可避免在印跡膜上沉淀免疫球蛋白 用于蛋白質印跡檢測的二抗。

免疫印跡（蛋白質印跡） – 避免抗體的背景條帶

一 免疫印跡（蛋白質印跡）最Chang用的問題 用于間接檢測的二抗是背景條帶引起的 通過樣品制備中的抗體來源于例如 免疫沉淀，裂解物中的細胞或組織自身免疫球蛋白或 牛免疫球蛋白污染（細胞裂解物中的FCS，BSA， 等）。從樣品中開槽的抗體重鏈和輕鏈之后 分別在 50 kDa 和 25 kDa 下減小 SDS-PAGE 顯示帶。 在非還原條件下，γ 免疫球蛋白 （IgG） 顯示 約150 kDa。

在免疫沉淀（IP）中，關注這個問題是最重要的;特別是在免疫沉淀之后，當目標蛋白預計在25kDa或50kDa范圍內時，必須解決這個問題。

這 IP后抗體背景帶問題Wan全可以 通過使用直接偶聯(lián)的一抗來旁路 檢測目標蛋白。然而，標記的一抗是 通常不可用，因此必須檢測未共軛的原發(fā)性 與二抗偶聯(lián)物。

一 防止抗體在印跡后被印跡的可能方法 免疫沉淀包括與蛋白 A/G 包被的交聯(lián)抗體 磁珠或共價偶聯(lián)抗體直接與處理過的磁珠。 然而，為了避免使用這種方法的抗體污染， 在非變性條件下洗脫抗原至關重要，因為 否則，變性抗體片段將用 抗原。

如果抗原上 使用非偶聯(lián)的一抗和 標記的二抗，可以通過選擇 某些要求下右二抗：

用于免疫沉淀和印跡檢測的一抗：

1.來自不同的寄主物種。

背景 印跡膜上沉淀抗體的條帶可通過以下方式避免 對物種無交叉反應（MinX）的二抗 沉淀抗體。

示例：用多克隆兔抗靶蛋白沉淀，用單克隆小鼠抗靶蛋白
檢測印跡>二抗抗小鼠IgG（H + L）MinX兔等。（例如，第 115-035-146 類）。

蛋白質印跡無種間交叉反應的抗 IgG/M （H+L） 列表 在以下位置查找更多用于蛋白質印跡的抗 Ig（H+L） 特異性抗體： 二抗

2. 來自同一宿主物種，并且

a.具有不同的同種型。

由 選擇針對 一抗抗體的子/類 識別 可以避免印跡膜上沉淀抗體。
示例： 用單克隆小鼠（IgG1）抗靶蛋白沉淀， 用單克隆小鼠 （IgG2a） 抗靶蛋白
>二抗抗小鼠 IgG2a（例如貨號 115-035-206）檢測印跡。

用于蛋白質印跡的抗 IgG 亞類和抗 IgM 特異性二抗列表

b.目標蛋白接近50 kDa。

針對小鼠IgG輕鏈的二抗不與小鼠IgG輕鏈（50kDa）的還原和變性重鏈（50kDa）反應 沉淀抗體。它們只與還原的變性光結合 沉淀抗體的鏈在印跡上（見圖）和 用于檢測的一抗的天然輕鏈。 因此，可以在沒有 來自誘發(fā)抗體的干擾。只有一個抗體條帶 輕鏈區(qū)域，但不在目標范圍內 檢測到蛋白質。

示例： 目標蛋白約50 kDa;使用單克隆小鼠沉淀 （IgG1）抗靶蛋白，用單克隆小鼠印跡檢測 （IgG1） 抗靶蛋白
> 二抗抗小鼠 Ig/G 輕鏈（例如貨號 115-035-174）。

c.目標蛋白接近25kDa。

針對小鼠IgG的Fc片段的二抗不與 沉淀抗體。它們只與減少的、變性的重物結合 印跡和重鏈上的沉淀抗體鏈和重鏈 用于檢測的天然一抗。因此，25 kDa 可以在印跡膜上檢測蛋白質，而不會受到 沉淀抗體。只有一個抗體條帶在 重鏈，但不在目標蛋白質的范圍內被標記。

示例：目標蛋白約 25 kDa;使用單克隆小鼠（IgG1）抗靶蛋白沉淀，用單克隆小鼠（IgG1）抗靶蛋白
>二抗抗小鼠IgG Fc（例如貨號115-035-071）檢測印跡。
用于蛋白質印跡的抗IgG Fc特異性二抗列表

注意：如果一抗在未還原的 形式以及目標蛋白是否與其大小等相關。可以顯示 在SDS-PAGE中，可以在不減少試劑的情況下應用樣品。 用于沉淀的一抗僅形成一種抗體 150 kDa的波段，不會干擾目標檢測 超出此分子量范圍的蛋白質。