摘要：ND4和ND5是線粒體基因組中編碼NADH脫氫酶亞基4和亞基5的兩個蛋白質編碼基因。本研究以鰍超科魚類為研究對象，新測定了10個物種的ND4和ND5基因全序列，結合從GenBank下載的15個物種的15條序列進行分析。結果顯示：鰍超科魚類ND4基因全長1380～1387bp，以ATG為起始密碼子，終止密碼子為不*終止信號；ND5基因全長1821～1839bp，同樣起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA或TAG；ND4和ND5基因之間插入了3個tRNA基因，分別編碼攜帶*、*、*的tRNA。ND4和ND5基因（包含3個tRNA基因）中A、T、G、C的平均含量分別為30.4%、27.3%、14.2%、28.1%，A+T （57.7%） 的含量高于G+C （42.3%） 的含量。轉換與顛換比（Ts/Tv）平均值為1.586。選取斑馬魚和鯉魚作為外類群，采用zui大簡約法（MP）、zui大似然法（ML）和貝葉斯推斷法（BI）進行系統發育樹的重建。三種方法的系統發育分析結果都顯示：花鰍亞科、條鰍亞科、沙鰍亞科、平鰭鰍科及Vaillanlidae分別構成單系；它們的系統發育關系為：（（（（條鰍亞科+平鰭鰍科）+花鰍亞科）+沙鰍亞科）+Vaillanlidae）。這與線粒體全基因組和某些核基因（如RAG1基因）的研究結果類似，且支持率較高，表明ND4和ND5基因用于鰍超科魚類的系統發育分析是可行的。但是本研究的結果有別于其它線粒體基因的分析結果，如基于cyt b和Dloop基因進行的系統發育分析認為條鰍亞科和花鰍亞科聚為姐妹群，再和平鰭鰍科聚在一起。這種差異可能是由于線粒體基因的信息量差異造成的，信息量越大，所反映的系統發育結果可能更加接近真實情況。

 

關鍵詞：鰍超科 ND4ND5基因 序列分析 系統發育

 

鰍超科（Cobitoidea）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）。鯉形目是世界上zui大的淡水魚類類群，約有3268種（Nelson,2006），在經濟發展和科學研究中占有很重要的地位。傳統的鯉形目魚類研究多以形態特征為基礎，其分類及系統發育關系還存在較多爭議，為此，美國自然科學基金資助了 “鯉形目生命樹（Cypriniformes Tree of Life, CToL）”的合作項目，希望聯合世界各國的魚類學研究者通過綜合魚類化石、形態特征及分子等各個方面的數據資料對鯉形目魚類的系統發育問題進行全面的研究。

鰍超科是鯉形目中較為重要的一個類群，其物種數約占整個鯉形目的26％（Nelson,2006）。到目前為止，鰍超科的分類及系統發育關系還未澄清。關于鰍超科的分類，Sawada（1982）根據48個種及亞種的52個骨骼及外部性狀特征，把鰍超科分為鰍科（Cobtidae）和平鰭鰍科（Balitoridae）兩個科，其中鰍科包括沙鰍亞科（Botiinae）和花鰍亞科（Cobitinae），平鰭鰍科科包括條鰍亞科（Nemacheilinae）和平鰭鰍亞科（Balitorinae）。而國內學者則大多數將條鰍亞科歸為鰍科（陳景星，1995；及各地方魚類志等）。目前上廣為接受的是Sawada（1982）的觀點（Nelson, 2006；Saitoh等2006）。后來的研究者將以上四個亞科分別提升到科的水平，但在系統發育關系上還存在爭議（Nalbant和Bianco,1998; Saitoh等2006；Tang等，2006；Šlechtová等2007）。

20世紀80年代后期以來，分子生物學技術在生物學各個領域中的迅猛發展，使分子數據更廣泛應用于魚類系統發育研究并發揮著重要作用。DNA序列包含極為豐富的系統發育信息，而且隨著PCR、DNA序列測定技術的發展使大量DNA序列的獲得趨于快捷、準確，相應構樹方法的不斷改進，也使得使用大量的分子性狀構建系統發育樹成為現實。線粒體是真核細胞內的重要細胞器，是能量產生與轉換的場所，還參與脂肪酸的合成及少量蛋白質的合成。ND4和ND5是線粒體基因組中編碼NADH脫氫酶亞基4和亞基5的兩個蛋白質編碼基因。ND4、ND5基因有相對較快的進化速率，比較適合系統發育關系的重建（Zardoya和Meyer,1996）。

就同一研究類群而言，與短片段序列數據集相比，長片段序列數據集具有更多的數據信息，能夠構建出更可靠的系統發育樹（參考文獻）。線粒體ND4、ND5基因及兩個基因間的3個tRNA基因的聯合序列（以ND4+5來表示）與應用廣泛的cyt b基因相比，具有更多的核苷酸位點，信息量大很多。因此，本研究采用ND4+5基因序列為分子標記，結合從GenBank數據庫獲得的其它15種鰍超科魚類的同源序列，以斑馬魚（Daniorerio）和鯉魚（Cyprinuscarpio）作外類群，重建鰍超科魚類的分子系統樹。

 

1.1 研究用標本 DNA測序分析采用的樣品均為95%的酒精固定標本，主要從國內各水系收集獲得，標本保存于*水生生物研究所淡水魚類博物館。具體種類及其它詳細信息見表1。

 

1.2 基因組DNA的提取 在本研究中，采用了兩種提取DNA的方法，一種為常規的酚-氯仿抽提法，另一種為高鹽抽提法。方法如下。

酚-氯仿抽提法，取魚背部肌肉適量于1.5mL的Eppendorf管中，用蒸餾水、TE（10mmol/L Tris.HCl，1mmol/L EDTA，pH=8.0）緩沖液浸泡，直到組織中無酒精味。然后加入620μL的SET（0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris.HCl，1mmol/L EDTA，pH=8.0）細胞裂解液，70μL10%的SDS，10μL蛋白酶K（10μg/μL），置于55℃的恒溫箱中消化至透明。加入等體積的平衡酚抽提兩次，再加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1）抽提，至無蛋白質。加入上清液兩倍體積的無水乙醇沉淀2h以上，離心后再用75%的乙醇洗滌沉淀，再離心去乙醇干燥后加入30-50μL的滅菌雙蒸水或TE緩沖液溶解，并存于-20℃的冰箱中備用。

高鹽抽提法，取魚背部肌肉適量于2mL的Eppendorf管中，剪碎烘干，加入500μL HOM Buffer和10～15μL蛋白酶K，置于55℃的恒溫箱中消化至透明。加入500μL NaCl（4.5mol），300μL氯仿離心。加入600μL異丙醇沉淀，于-20℃保存1h以上，離心后再用70%乙醇洗滌，干燥后加入50μL滅菌雙蒸水溶解，同樣存于-20℃的冰箱中備用。

 

1.3 PCR擴增 ND4+5基因序列全長3387～3443bp。在mtDNA上，ND4基因左側是ND4L基因，ND5基因右側是ND6基因，ND4和ND5基因之間是3個tRNA基因。基于此結構，分別在ND4L、ND6基因的側翼區及ND4、ND5基因內部設計引物。用于擴增的引物共5對：LArgd1+H11618d；L11427dA+H12632dB；L12328d+H13393d；L13058d+H13721d；L13559d+H14710d。

PCR反應的總體積為60μL，反應體系包括：10×Buffer 6μL，dNTPs 1.2μL（每個堿基濃度為2.5mmol/L），引物各1.5μL（10pM），Taq酶3.0U。PCR反應條件為：95℃預變性3min，然后循環包括：94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環，zui后再72℃延伸5min。

 

1.4 PCR產物的純化和測序 PCR產物用1.0%的瓊脂糖電泳檢測，并在紫外投射儀上觀察。PCR產物用試劑盒進行割膠回收或直接過柱回收。回收產物送上海生工生物公司測序。

 

1.5 數據分析 DNA序列的排列使用ClustalX軟件，并進行手工調整。從GenBank下載鰍超科魚類和外類群魚類的ND4＋5基因序列。通過比對分析找出序列的起始密碼子（ATG）和終止密碼子，刪除起始密碼子前和終止密碼子后的堿基。序列中各堿基的含量及變異情況用Mega4.0中的Statistic命令進行分析。用PAUP^*軟件統計出序列中轉換和顛換的數目以及序列的變異情況（用GTR模型下的遺傳距離，GTR distances），并在Statistica 6.0軟件中進行作圖分析序列中堿基替代的飽和程度。分子系統樹的構建采用zui大簡約法（MP）、zui大似然法（ML）和貝葉斯推斷法（BI），其中MP和ML法采用為PAUP^*4.0b10（Swofford,2002）軟件，BI法采用MrBayesV3.0（Ronquist和Huelsenbeck,2003）軟件。

 

2.1 鰍超科魚類ND4＋5基因序列與遺傳變異分析 鰍超科魚類ND4基因全長1380～1387bp，以ATG為起始密碼子，終止密碼子為不*終止信號；ND5基因全長1821～1839bp，同樣起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA或TAG；ND4和ND5基因之間插入了3個tRNA基因，分別編碼攜帶*、*、*的tRNA，序列長度分別為70bp、68bp、73bp。ND4＋5基因中A、T、G、C的平均含量分別為30.4%、27.3%、14.2%、28.1%，A+T （57.7%） 的含量高于G+C （42.3%） 的含量。

基于Kimura雙參數模型計算遺傳距離，以確定類群間的遺傳分化程度，結果顯示類群間的遺傳距離值為0.203～0.255（表2）。鰍超科ND4＋5基因序列轉換與顛換之比（Ts/Tv）的變異范圍為0.983～9.579，平均值為1.586。在供分析的3462個位點中，共有1899個變異位點，其中簡約信息位點為1525個。圖1顯示所有個體ND4+5基因序列的轉換和顛換均未達到飽和，說明序列中的替代均具有系統發育意義，可用于數據分析。在所有的變異水平上，轉換數明顯大于顛換數。

 

2.2 分子系統樹 基于目前的數據，我們分析了鰍超科魚類五個不同的類群，條鰍亞科，花鰍亞科，沙鰍亞科，平鰭鰍科和Vaillanlidae。其中Vaillanlidae只包含一個屬Vaillanla，該屬只分布于印尼及馬來西亞一帶（fishbase）。使用zui大簡約法（MP）、zui大似然法（ML）和貝葉斯推斷法（BI）構建分子系統樹。三種方法構建的分子系統發育樹的拓撲結構基本一致（圖2－4）。

以斑馬魚（Danio rerio）和鯉魚（Cyprinus carpio）作外類群，三種構樹方法的結果一致顯示，鰍超科的系統發育關系為：（（（條鰍亞科+平鰭鰍科）+花鰍亞科）+沙鰍亞科）+Vaillanlidae）；條鰍亞科、平鰭鰍科、花鰍亞科、沙鰍亞科和Vaillanlidae這五個類群都各自獨立形成單系，且都得到較高的支持率（均超過90；見圖2-4）；條鰍亞科和爬鰍科的魚類聚在一起構成一個分支（lineage），均得到較高的支持（MP樹中為自展支持率（bootstrap value, BP）為50，ML樹中BP為68， BI樹中后驗概率（posterior probability，PP）為94）。該分支與花鰍亞科構成姐妹群，然后再與沙鰍亞科一起構成一個大的分支群。Vaillanla處于所有鰍類的根部位置，成為一個獨立的分支，其支持率較高（MP樹中為78，ML樹中為76，BI樹中為100）。至于每個類群內部物種間的系統發育關系，MP樹（圖2）、ML樹（圖3）和BI樹（圖4）的拓撲結構幾乎一致，只在部分樣本（花鰍亞科中花鰍屬的三個物種及條鰍亞科中的四個物種）的分支順序存在差異。

平鰭鰍科明顯分為兩個支系：平鰭鰍亞科和腹吸鰍亞科，它們分別構成單系群。腹吸鰍亞科的支持率在三種方法構建的分子系統發育樹中都為100%，平鰭鰍亞科的支持率分別為82%（MP樹）、68%（ML樹）和98%（BI樹）。花鰍亞科中，花鰍屬（Cobitis）和泥鰍屬（Misgurnus）的物種都能分別構成單系,且支持率很高（見圖2-4）。由圖可知，ML樹和BI樹中花鰍屬的聚類情況跟MP樹中花鰍屬的聚類情況有所不同。本研究的樣本包含沙鰍亞科中的兩個屬：沙鰍屬（Botia）和薄鰍屬（Leptobotia）（陳景星，1980；Nelson，1994；唐瓊英等，2008），在三種樹中各自構成單系。

 

3.1 ND4和ND5基因的特點及在系統發育分析中的應用 mtDNA不同區段基因序列的進化速度不一樣（李耀東和邵嘉會，2006）。因此，選取mtDNA上的不同基因或片段序列，可以進行不同分類水平上的進化研究。對于親緣關系較遠的物種，一般選取選擇壓力大、比較保守的基因序列；對于親緣關系較近的物種，則選取選擇壓力小、進化較快的基因序列。

    Cyt b基因的序列長度在各科之間的差異很大，但科內之間的序列長度是一致的，因此cyt b序列是可用來研究科內屬間的系統發育關系（Akihito等，2000；Reed和Carpenter，2002）。NADH作為線粒體呼吸鏈上的一種功能蛋白，它的基因序列一般很少被用來研究系統發育。從本研究的結果來看，在進行同一個目內科水平親緣關系較遠的種群系統發育分析時，ND4和ND5基因也不乏一個好的研究序列。

也有研究結果表明，在高階元類群的分子系統發育研究中不要使用cyt b和12S/16S rRNA基因作為分子標記（Meyer，1994；Ortí和Meyer，1997；Farias等，2001），但這些基因仍然作為許多魚類系統發育的“標準”分子標記而被廣泛使用。由于cyt b和12S/16S rRNA基因容易擴增，所以它們被測序的頻率與其它線粒體基因相比遠遠高出4倍多（Miya等，2006）。除此之外，這些基因在系統發育分析上的表現并不比其它線粒體基因表現出更多的*性（Miya和Nishida，2000）。

另外，在重建高水平的系統發育關系上，序列長度逐漸成為一個評價基因特征的重要方面。考慮到類群樣本數量的限制，序列約3kb是一個較為理想的長度（Miya等，2006）。ND4+5基因全長3387～3443bp，與cyt b基因（1140bp）相比，包含更多的系統發育信息，將該標記用于分子系統發育分析，可能會得到更為準確的系統發育關系。

就ND4和ND5基因而言，這兩個基因單獨用于系統發育關系的研究已有很多。張四明等（1999）分析12種鱘形目魚類的ND4基因的序列變異，確定了部分鱘魚的親緣關系。Mou等（2005）以ND4L和ND4基因為標記研究了黑腹果蠅的系統發育關系。張祖興等（2006）對ND5基因進行克隆和序列分析，進一步確定了大黃魚的分類地位。Makita等（2000）將ND5應用于虎鳳蝶屬（ Luehdorfia）的種間研究，結果顯示，Luehdorfia 屬的種和外群蝴蝶種間ND5基因差異較大，同屬內不同物種間ND5基因的差異相對要小。

本研究將ND4和ND5基因聯合起來，對鰍超科魚類的系統發育關系進行分析，重新將各類群之間的關系整理了一遍。

 

3.2 鰍超科系統發育關系 鰍超科中關于鰍科和平鰭鰍科魚類劃分的問題，一致存在爭議。Sawada（1982）和Siebert（1987）基于外部形態和骨骼特征的分析結果認為，鰍科只含兩個亞科：花鰍亞科和沙鰍亞科，他們認為條鰍亞科與平鰍鰍科的成員有較近的親緣關系，條鰍亞科應歸為平鰭鰍科的成員。后來的研究認為條鰍亞科和平鰭鰍科的成員在形態上及分子上均存在較大的差異（朱松泉，1995；Nablbant和Bianco，1998；Tang，2006）。Nalbant和Bianco（1998）認為Sawada（1982）研究中所用的骨骼性狀，在條鰍亞科和平鰭鰍科中較為相似是因為二者趨同進化形成的，因此Nalbant和Bianco（1998）將條鰍亞科作為一個獨立的科對待。Tang（2006）基于線粒體cyt b和Dloop基因的分析結果認為，條鰍亞科和花鰍亞科構成姐妹群，再和平鰭鰍科聚在一起。

本研究立足于分子水平，以ND4+5基因作為分子標記所得出的結果與核基因（Šlechtová等，2007）及線粒體全基因組（Saitoh等，2006）作為分子標記所得出的結果一致，即條鰍亞科和平鰭鰍科構成姐妹群，再和花鰍亞科聚在一起。說明條鰍亞科魚類與平鰭鰍科魚類的有更近的親緣關系。

這種結果的差異可能是由于基因的信息量差異造成的，信息量越大，所反映的系統發育結果可能更加接近真實情況。因此，當樣本質量不好導致某些核基因很難擴增出來的時候，ND4+5基因可以作為一個很好的分子標記進行分析。

本研究中，Vaillanla處于所有鰍類的根部位置，成為一個獨立的分支，其支持率較高（MP樹中為78，ML樹中為76，BI樹中為100）。曾有研究對Vaillanla的系統發育位置持不同的觀點。Sawada（1982）和Siebert（1987）基于形態數據分析研究顯示，Vaillanla被分別歸為兩個不同科的物種。有人提出將這個屬劃分到一個獨立的科Vaillanlidae（Nalbant和Bǎnǎrescu，1977；Šlechtová等，2007）。我們的研究支持這個觀點。

分子系統樹顯示：條鰍亞科中兩個南鰍屬（Schistura）的物種沒有聚類在一起。在MP樹中，橫紋南鰍（Schistura.fasciolata）與平頭平鰍（Oreonectes.platycephalus）聚在一起。而在MP樹和BI樹中，橫紋南鰍（Schistura.fasciolata）與Barbatula.toni聚在一起。由此推斷，南鰍屬可能不是一個單系。

 

 

 

陳景星. 1980. 中國沙鰍亞科魚類系統分類的研究[J]. 動物學研究，1（1）：3-25

李耀東，邵嘉會. 2006. 線粒體基因組全序列研究與動物分子系統發生的關系[J]. 青海醫學院學報，27 （1）：68-70

唐瓊英，俞丹，劉煥章. 2008. 斑紋薄鰍（Leptobotia zabra）應該為斑紋沙鰍（Sinibotia zabra）[J]. 動物學研究，29（1）：1-9

張四明，張亞平，鄭向忠等. 1999. 12種鱘形目魚類mtDNA ND4L-ND4基因的序列變異及其分子系統學[J]. 中國科學，29（6）：607-614

張祖興，李明云，朱俊杰. 2006. 大黃魚mtDNA ND5和Cyt b基因的克隆與序列分析[J]. 水產科學，25（12）：626-631

朱松泉. 1995. 中國淡水魚類檢索. 江蘇：江蘇科技出版社

Akihito, Akihisa Iwata, Takanori Kobayashi, et al. 2000. Evolutionary aspects of gobioid fishes based upon a phylogenetic analysis of mitochondrial cytochrome b genes [J]. Gene, （259）：5-15

David L Reed, Kent E Carpenter, et al. 2002. Molecular systematics of the Jacks （Perciformes: Carangidse） based on mitochondrial cytochrome b sequences using parsimony, likelihood, and Bayesian approaches [J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, （23）：513-524

Faias I.P., Ortí G., Sampaio I., Schneider I., Meyer A., 2001. The cytochrome b gene as a phylogenetic marker: The limits of resolution for analyzing relationships among cichlid fishes [J]. Mol. Evol., 53：89-103

Makita H., Shinkawa T., Ohta K. et al. 2000. Phylogeny of Luehdorfia butterflies inferred from mitochondrial ND5 gene sequences[J ]. Entomological Science., 3（2）：321-329

Miya M., Saitoh K., Wood R., et al. 2006. New primers for amplifying and sequencing the mitochondrial ND4/ND5 gene region of the Cypriniformes （Actinopterygii: Ostariophysi） [J]. Ichthyol. Res., 53：75-81

Meyer A., 1994. Shortcomings of the cytochrome b gene as a molecular marker [J]. Trends Ecol Evol., 9：278-280

Mou S. L., Zeng Q. T., Yang Y., et al. 2005. Phylogeny of melanogaster Species Group Inferred from ND4L and ND4 Genes [J]. Zoological Research., 26（4）：344-349

Miya M., Nishida M., 2000. Use of mitogenomic information in eostean molecular phylogenetics: A tree-based exploration under the maximum-parsimony optimality criterion [J]. Mol Phylogenet Evol., 17：437-455

Nalbant, T. T., Bǎnǎrescu, P., 1977. Vaillanlinae, a new sub-family of Cobitidae （Pisces, Cypriniformes）. Zool. Meded., 52：99-105

Nalbant T T, Bianco P G. 1998. The loaches of Iran and adjacent region with description of six new species （Cobitoidea）. Ital J Zool, 65. Suppl, 109-123

Nelson, J.S., 2006. Fisher of the World, fourth ed. John Wiley and Sons, Hoboken

Nelson J. S., 1994. Fishes of the world. 3^rd ed. New York: John Wiley & Sons

OrtíG, Meyer A., 1997. The radiation of characiform fishes and the limits of resolution of mitochondrial ribosomal DNA sequences [J]. Syst Biol., 46：75-100

Ronquist, F. and Huelsenbeck. J. P., 2003. MRBAYES 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models [J]. Bioinformatics, 19：1572-1574

Saitoh K., Sado T., Mayden R. L., et al. 2006. Mitogenomic Evolution and Interrelationships of the Cypriniformes （Actinopterygii: Ostariophysi）: The First Evidence Toward Resolution of Higher-Level Relationships of the World’s Largest Freshwater Fish Clade Based on 59 Whole Mitogenome Sequences [J]. J Mol Evol., 63：826–841

Sawada Y., 1982. Phylogeny and zoogeography of the superfamily Cobitoidea （Cyprinoidei, Cyprinionfrmes）. Mem Fac Fisher. Hokkaido Univ., 28（2）： 65-223

Siebert D. J., 1987. Interrelationships among families of the order Cypriniformes （eostei）, （Ph D Dissertation）, New York:：City University of New York

Šlechtová, V., Bohlen, J., Tan, H., H., 2007. Families of Cobitoidea （eostei: Cypriniformes） as revealed from nuclear genetic data and the position of the mysterious genera Barbucca, Psilorhynchus, Serpenticobitis and Vaillanla [J]. Mol. Phylogenet. Evol., 44：1358-1365

Swofford D L. 2002. PAUP*: Phylogenetic Analysis Using Parsimony（*and other Methods）. Version 4. Sunderland, Massachusetts: Sinauer Associates

Tang, Q., Liu, H., Mayden, R., Xiong, B., 2006. Comparison of evolutionary rates in the mitochondrial DNA cytochrome b gene and control region and their implications for phylogeny of the Cobitoidea （eostei: Cypriniformes） [J]. Mol. Phylogenet. Evol., 39：347-357.

Zardoya, R., and Meyer, A., 1996 Phylogenetic performance of mitochondrial protein coding genes in resolving relationships among vertebrates [J]. Molecular Biology and Evolution 13：933-942.