實驗原理受體細胞經過一些特殊方法如化學試劑法的處理后,細胞膜的通透性發生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞。進入受體細胞的DNA分子通過復制,表達實現遺傳信息的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在篩選培養基中培養,即可篩選出轉化子(即帶有異源DNA分子的受體細胞)。
CaCl2法的基本原理:細菌處于0℃,CaCl2低滲溶液中,細胞膨脹成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸鹽混合物黏附于細胞表面,經短時間42℃熱激處理,促進細胞吸收DNA復合物。將細菌放置在非選擇性培養基中保溫一段時間,促使在轉化過程中獲得的新的表型,如氨芐青霉素耐藥(Ampr)得到表達,然后將此細菌培養物涂在含Amp的選擇性培養基上,倒置培養過夜,可獲得細菌菌落。
轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。
一、材料
pUC19質粒,大腸桿菌感受態,1.5ml塑料離心管,離心管架,
1000 ul、200ul槍頭,9cm培養皿,一次性濾膜(0.22um),大量碎冰
二、設備
微量移液器(2μl,200μl,1000μl),高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋),培養箱,恒溫水浴鍋,恒溫搖床,離心機 超凈工作臺,雙蒸水器,冰箱等。
三、試劑準備
LB固體培養基
LB液體培養基
氨芐青霉素(apm):無菌水配置成100mg/ml溶液,用濾膜抽濾,-20℃保存
滅菌雙蒸水ddH2O
四、實驗操作
(1) 平板的制備:LB固體培養基中加入Amp (100μg/ml),轉化反應前一天,倒置平板,保存。
(2) 分別用2個100µl感受態細胞懸液(如是冷凍保存液,則需化凍后馬上進行下面操作:
*組,質粒DNA組:2 µl pUC19質粒DNA +100µl感受態細胞懸液
第二組,空白對照組,2ul無菌水+100µl感受態細胞懸液
(3) 將以上各樣品輕輕搖勻,冰上放置20-30min,于42℃水浴中保溫90s,然后迅速冰上冷卻2min
(4) 立即向上述管中分別加入0.4ml LB液體培養基(在超凈工作臺操作,不需要在冰上),使總體積到0.5ml,搖勻后于37℃振蕩培養約30-60min,使受體菌恢復正常生長狀態,并使轉化體表達抗生素基因產物(Ampr)。
(5) 將培養液以5000rmp離心2min,在超凈工作臺取各樣品培養液0.1ml在平板上涂布,分別接種于含抗菌素LB平板培養基上(做好標記,日期),涂勻。
(6) 在菌液*被培養基吸收后,培養皿倒置于37℃培養箱中過夜(12-16小時),
觀察轉化子出現的情況,待菌落生長良好而又未互相重疊時停止培養。(子科生物技術部編輯)