酵母雙雜交實驗常見問題及其解決方法:

1.如果誘餌蛋白對酵母細胞是有毒的，該怎么辦?

在某些情況下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)不好的菌珠可以在固體培養(yǎng)基上生長得很好。首先重懸克隆于1ml的SD/–Trp，接著將重懸液平鋪于5 個100-mm的SD/–Trp平板，在30℃下溫浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每塊板上的克隆，并收集到一管中，這樣就可以使用這個細胞重懸液進行正常的雜交反應。

2.如果誘餌蛋白能直接激活報告基因的表達，該如何處理?

該蛋白很可能有轉(zhuǎn)錄激活域，是個轉(zhuǎn)錄因子。可以通過基因重組切掉轉(zhuǎn)錄激活域，然后重新檢測其是否自激活，但要注意重組也有可能破壞蛋白之間的互作。

3.轉(zhuǎn)化效率太低怎么辦?

可以采用以下方法解決：

1)檢測一下DNA的純度，如果可以的話，重新用乙醇純化。

2)DNA-BD/誘餌蛋白很可能是有毒的。

3)不適當?shù)呐囵B(yǎng)基，重新配制培養(yǎng)基，并做對照轉(zhuǎn)化。

4)檢測pGBT9對照載體的轉(zhuǎn)化效率，放置于SD/–Trp平板上，轉(zhuǎn)化效率應該在1 x105 colonies/mg DNA以上。

4.雜交效率不高，該如何處理?

在雜交中，預轉(zhuǎn)化的誘餌細胞的數(shù)量可能不夠。當對誘餌菌株進行液體培養(yǎng)過夜時，應挑選大的、新鮮的克隆進行培養(yǎng)，經(jīng)過離心和重懸后，再使用血球計對細胞進行計數(shù)。密度應該在1 x109/ml。

一個甚至兩個融合蛋白對酵母細胞有毒。你可以通過重組方法來減輕毒性，同時又能保證蛋白的相互作用。或者使用表達水平較低的載體。也可以在瓊脂平板或濾膜上進行雜交。但同時必須作雜交對照實驗。

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