Elispot的歷史可以追溯到1963年Jerne等人創立的溶血空斑技術(hemo-lytic plaque forming cell assay ，HPF)，這項技術可用于檢測并計數單個抗體形成細胞。隨著單克隆抗體技術的成熟，1983年，Czerkinsky等采用此法檢測脾細胞中分泌特異性抗體的細胞數，發現該方法敏感性高簡便易行。后來，他們又用這種方法定量分析受到有絲分裂原刺激的外周血中分泌IFN2γ的細胞數。隨后，用ELISPOT法在單細胞水平檢測分泌其他細胞因子(如IL-2 ， IL-4 ， IL-5 ， IL-10 ， TNFα和IL-6) 數量的手段也被建立起來。Nordstrom 等用生物素-抗生物素蛋白生物放大來提高這種方法的敏感性，Herr用計算機輔助圖像分析系統(computer-assisted video image analysis ，CVIA) 自動分析TNF2α酶聯免疫斑點的大小和數量，計算與負載抗原肽的靶細胞接觸后外周血單核細胞(PBMC) 中抗原特異性CD8+T細胞的數量，不但提高了對背景染色的分辨力也使大規模研究成為可能。Vaquerano等將數碼相機和計算機結合起來，開發出類似的斑點計數系統，認為當每孔斑點數大于100時，這種方法更客觀、可重復性高且節省時間。

隨著ELISPOT技術的不斷發展，它的優勢也漸漸顯示出來，下面將列舉ELISPOT對比其它一些傳統技術的優勢所在。

一、elisa

ELISA 通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。ELISPOT 也是通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數斑點或通過計算機輔助的分析系統對斑點進行計數， 1個斑點代表1個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。(某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率) 由于是單細胞水平檢測，ELISPOT比ELISA更靈敏，能從20萬-30萬細胞中檢出1個分泌該蛋白的細胞。捕獲抗體具有高親和力、高特異性、低內毒素的單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。

二、有限稀釋法(limiting dilution analysis ，LDA)

LDA能夠對特異性CTL細胞進行定量，曾在很多年中被認為是CTL 檢測的“金標準”，它使人們能夠詳細了解免疫反應動力學和記憶毒性T淋巴細胞(memorial CTL， mCTL) 亞群的細胞周期。但該方法需要高強度抗原刺激， 這會加快效應CTL(eCTL)凋亡，且不能定量測定eCTL細胞數量或測定值偏低。其次，該方法較繁瑣，培養時間可長達2～3周，而且很容易造成T細胞數量損失。

三、四聚體法(Tetramer)

zui近幾年出現了MHC2Ⅰ類分子抗原肽四聚體法。該法的優勢在于迅速、直接、靈敏且特異性強，即使當體內mCTL水平低于1%，用MHC2Ⅰ抗原肽四聚體法仍可直接測到準確的值，比LDA 敏感度要高5～10倍。但該技術也存在較多應用上的困難：除了合成及穩定MHCⅠ類分子的技術困難外，zui主要缺點是表位的選擇。由于每次反應只能分析單一的抗原表位，而MHCⅠ類分子結合的各種表位，能否形成CTL反應，卻隨著基因背景及時間的變化而變化，因此選擇正確的表位就顯得尤為重要。優勢表位的篩選可以通過Elispot 來進行，但對整個肽庫進行掃描，并不是一件很容易的事。當然，生物信息學的運用對表位的篩選有很大的幫助。同時，有研究結果表明，并非所有經過Tetramer 鑒定的陽性細胞都有確切的功能， Tetramer陽性的細胞數是用ELISPOT分析能分泌INF2γ細胞數的10倍，其中很多是不表現功能的惰性細胞，可能代表了記憶型CTL前體細胞。Tetramer分析只增加了分析的靈敏度，同時測定其功能很重要。

四、Cr51釋放法

此法是一種比較經典的方法，雖然在檢測CTL識別的抗原多樣性方面非常有效，且能闡明被CTL識別的表位，但至多為半定量的層面，而且Cr51標記細胞的自發釋放率較高，不適于較長時間培養;標記時所需的細胞濃度較高，因而給試驗帶來諸多不便;此外，Cr51釋放法所測定的是一個細胞群體的特性，而不是單個細胞。

五、胞內CK染色法

與ELISPOT法相比較，胞內CK染色法(intra-cellular CK staining，ICS) 主要應用細胞內累積細胞因子的染色和多色參數的FACS法，是檢測循環淋巴細胞中抗原特異性T 淋巴細胞的可行方法，而ELISPOT法卻可以檢測所有分泌CK的eCTL。

深圳子科生物科技有限公司技術部編輯，僅供參考！