【目的和要求】

1.學(xué)會(huì)CTAB法提取細(xì)菌總DNA。

2.掌握DNA的瓊脂糖凝膠電泳法。

【實(shí)驗(yàn)原理】

DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的，因此提取出脫氧核糖核蛋白復(fù)合物后，必須將其中蛋白質(zhì)去除。CTAB(溴代十六烷基*胺)是一種去污劑，它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中可溶并且穩(wěn)定存在，若降低鹽濃度，CTAB與核酸的復(fù)合物會(huì)沉淀出來，而大部分蛋白和多糖仍溶于溶液中。

DNA的電泳原理與蛋白質(zhì)的電泳原理基本相同。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于DNA分子或DNA片斷的分子量差別，電泳后呈現(xiàn)遷移位置的差異。

【實(shí)驗(yàn)試劑和器材】

(一)試劑：

菌株(E.coli );蛋白酶k(20mg/ml);瓊脂糖;標(biāo)準(zhǔn)DNA水解液

1.10%SDS

2.酚/氯防/異戊醇(1/1/1)

3.異丙醇;70%乙醇

4.LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl 10g加蒸餾水至1升，然后滅菌備用。

5.TE緩沖液：10mM Tris• HCl,0.1mM EDTA (pH8.0)。

6. CTAB/NaCl溶液(5% w/v)：5g CTAB 溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需要加熱到65℃使之溶解，然后室溫保存。

7.TAE緩沖液(50×)(pH8.0)：每升溶液中含有242g Tris,57.1ml 冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA。電泳時(shí)稀釋成1× 濃度使用。

8.溴酚蘭-甘油指示劑：先配制0.1%溴酚蘭水溶液，然后取1份0.1%溴酚蘭溶液與等體積的甘油混合即成

9.0.5μg/ml 溴乙啶染液：稱取5mg溴乙啶，用重蒸水溶解定容到10ml,取1ml此溶液用1xTAE緩沖液稀釋到1升，zui終濃度為0.5μg/ml。

(二)器材：

錐形瓶(250ml)，1.5ml 離心管，水浴鍋，離心機(jī)，電泳槽，電泳儀，搖床，移液槍，潔凈工作臺(tái)，電磁爐，紫外成像儀

【實(shí)驗(yàn)方法】

(一)細(xì)菌總DNA的提取

1.將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)過夜。

2.取1.5ml培養(yǎng)物12000rpm離心2min。

3.沉淀物加入567μl的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30μl 10%SDS和15μl的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h.

4.加入100μl 5mol/L NaCl,充分混勻，再加入80μl CTAB/NaCl溶液，混勻后再65℃溫育10min。

5.加入等體積的酚/氯防/異戊醇混勻，離心4-5min,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。

6.沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇，在潔凈工作臺(tái)中稍加干燥，重溶于20μl TE緩沖液(含RNaseA-25ng/ml)中，準(zhǔn)備電泳檢測(cè)。

(二)瓊脂糖凝膠電泳

1.制膠：稱取瓊脂糖粉末，置于三角瓶中，加入TAE緩沖液配成0.8%的濃度，加熱使瓊脂糖全部融化于緩沖液中，待溶液溫度降至65℃時(shí)，立即倒入制膠槽中，插入樣品梳。在室溫放置0.5-1h，待凝膠全部凝結(jié)后，輕輕拔出樣品梳。然后在電泳槽中加入電泳緩沖液直到?jīng)]過凝膠為止。

2.加樣：取0.5-1μg 左右的樣品，體積為10-20μl，加入1/4體積的溴酚蘭-甘油指示劑，混勻后小心地加到樣品槽中。同時(shí)另取一個(gè)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA水解液，在同一凝膠板上進(jìn)行電泳。

3.電泳：維持恒壓100V，電泳0.5-1h，直到溴酚蘭指示劑移動(dòng)到凝膠底部，停止電泳。

4.染色：

將凝膠取出后浸入0.5mg/ml 溴乙啶溶液中，染色0.5-1h。染液可反復(fù)多次使用。

5.觀察：

將凝膠板置于254nm波長(zhǎng)紫外燈下進(jìn)行觀察。DNA存在的位置呈現(xiàn)橙黃色熒光。

【注意事項(xiàng)】

1.溴乙啶有毒，配制和使用溶液時(shí)要戴手套，勿將溶液滴灑在臺(tái)面或地面上。溴乙啶溶液于室溫保存在棕色瓶中。

2.倒凝膠板時(shí)不要太厚，否則影響電泳效果。

深圳子科生物科技有限公司技術(shù)部編輯！