深圳子科生物報道：肌萎suo性側(cè)索硬化癥（ALS）是一種逐漸致命的疾病，身殘志堅ALS患者——著明理論物理學(xué)家霍金，以及為資助漸凍癥研究而發(fā)起的冰桶挑戰(zhàn)，令越來越多人了解和關(guān)注這一疾病。盡管肌萎suo性側(cè)索硬化癥（ALS）目前尚無法治愈，但部分患者的致病原因可能由超氧化物歧化酶1（SOD1）基因的突變引起，這就成為了研究人員的一個研究突破點。CRISPR堿基編輯器具有修改DNA堿基的能力，有可能用于引入終止密碼從而永jiu關(guān)閉突變的SOD1基因表達(dá)，為治療這種疾病帶來希望。但是，腺相關(guān)病毒（AAV）載體的限制性攜帶能力限制了其治療應(yīng)用。伊利諾伊大學(xué)Urbana-Champaign 分校的科學(xué)家們報告了他們采用創(chuàng)新的方法利用CRISPR堿基編輯器令A(yù)LS小鼠模型中突變的SOD1基因失活，使得基因編輯動物的肌肉萎suo率降低，功能改善。

在這項研究中，研究人員建立了一個內(nèi)含肽介導(dǎo)的反式剪接系統(tǒng)（intein-mediated trans-splicing system），該系統(tǒng)可在活體內(nèi)遞送一種由化膿性鏈球菌Cas9蛋白構(gòu)成的胞嘧啶堿基編輯器（CBE） 。鞘內(nèi)注射（intrathecal injection）雙重AAV腺相關(guān)病毒顆粒——其中包含編碼的分裂內(nèi)含肽CBE用于反式剪接，在小鼠模型的突變SOD1基因前端引入了一個終止密碼，結(jié)果顯示延長了編輯小鼠的生存期，并顯著減緩了G93A-SOD1 ALS小鼠模型的疾病進(jìn)程。與對照小鼠相比，使用這種CRISPR堿基編輯器處理的成年小鼠肌肉萎suo率降低，減少了肌肉的去神經(jīng)化，改善神經(jīng)肌肉功能，并且末期小鼠的SOD1免疫反應(yīng)性包含體減少多達(dá)40％。

這項工作擴(kuò)展了單堿基編輯器的功能，并展示了其在基因治療中的潛力。

生物工程學(xué)教授Thomas Gaj與生物工程學(xué)教授Pablo Perez共同領(lǐng)導(dǎo)了這項研究，他說：“ALS幾乎沒有治療選擇。這項研究是重要的第1步，表明這種新形式的基因編輯有望用于治療這種疾病。”

該方法依賴于一種新興的基因編輯技術(shù)，即CRISPR堿基編輯器。傳統(tǒng)的CRISPR基因編輯技術(shù)會切割DNA分子的兩條鏈，這可能會在DNA序列中引入各種錯誤，從而限制了其有效性和潛力，并有可能導(dǎo)致基因組中許多意外突變。Perez-Pinera說，伊利諾伊州研究小組使用堿基編輯器能夠“將DNA序列的一個字母更改為另一個字母，而無需切斷兩條DNA鏈”。

Gaj說：“腺相關(guān)病毒是zui有前途的基因治療載體之一，但是傳統(tǒng)的堿基編輯器太大，無法借助腺相關(guān)病毒傳遞到細(xì)胞中。” 在2019年，Perez-Pinera的小組開發(fā)了一種將堿基編輯器蛋白分成兩半、由兩個單獨的AAV病毒顆粒一起遞送到細(xì)胞內(nèi)，這就是前面說的雙重AAV方法。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，兩半便重新組裝成全長堿基編輯蛋白。

通過將堿基編輯器分開兩半、再結(jié)合AAV基因傳遞功能，Gaj和Perez-Pinera成功在小鼠模型中靶向并永jiu關(guān)閉了突變的SOD1基因——這種基因突變類型約占遺傳性肌萎suo性側(cè)索硬化癥的20％。他們的研究結(jié)果發(fā)表在《分子療法》雜志上。

研究生Colin Lim說：“許多ALS研究的重點是預(yù)防或延緩疾病的發(fā)作。但是，在現(xiàn)實世界中，大多數(shù)患者直到癥狀出現(xiàn)后才被診斷出來。。。。延緩疾病進(jìn)展可能會對患者產(chǎn)生更大的幫助。” Lim是該研究的第1作者，作者還包括研究生Michael Gapinske和Alexandra Brooks。

研究人員首先在人體細(xì)胞中測試了SOD1堿基編輯器，以驗證被一分為二的CRISPR堿基編輯器能夠在細(xì)胞內(nèi)重組并且能令SOD1基因的失活。然后他們將編碼堿基編輯器的AAV顆粒注入攜帶突變SOD1基因的小鼠的脊柱中——該SOD1基因突變引起特別嚴(yán)重的ALS形式，在出生后幾個月內(nèi)使小鼠癱瘓。

接受治療的小鼠表現(xiàn)為疾病進(jìn)展顯著減緩，具有改善的運動功能，更大的肌肉力量，體重減輕程度更少。研究人員觀察到，從疾病晚期到末期之間的生存時間增加了85％，總生存期提高了。

Gapinske說：“我們很高興地發(fā)現(xiàn)，疾病發(fā)作后出現(xiàn)了許多改善。這告訴我們，我們正在延緩疾病的進(jìn)展。”

堿基編輯器在SOD1基因的起始位置附近引入了一個終止信號，因此，無論患者具有哪種基因突變，它都具有阻止細(xì)胞產(chǎn)生突變蛋白的優(yōu)勢。但是，它同樣可能破壞基因的健康版本，因此研究人員正在探索靶向基因突變體拷貝的方法。

Gaj說：“展望未來，我們正在考慮如何將這項技術(shù)和其他基因編輯技術(shù)帶入臨床，以便有朝一日能夠治療患者的ALS。” “為此，我們必須開發(fā)能夠靶向該疾病所涉及的所有細(xì)胞的新策略。我們還必須在其他臨床相關(guān)模型中進(jìn)一步評估這種方法的效率和安全性。”

Perez-Pinera說，基于堿基的編輯方法也具有利用遺傳學(xué)方法治療其他遺傳疾病的潛力。盡管ALS是該工具的首ge演示，但他的小組正在進(jìn)行研究以將其應(yīng)用于Duchenne肌營養(yǎng)不良癥和脊髓性肌萎suo癥。