目的： 建立利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小鼠MAD2L1基因第二外顯子基因編輯的方法體系，并分析CRISPR/Cas9對MAD2L1基因編輯的脫靶效應(yīng)。

方法： 通過CHOPCHOP設(shè)計位于小鼠MAD2L1基因第二外顯子的靶點序列，并構(gòu)建Cas9-MAD2L1載體，將該載體轉(zhuǎn)染到NIH/3T3細胞中，通過嘌呤霉素篩選并結(jié)合熒光顯微鏡觀察GFP后，提取細胞轉(zhuǎn)染后的基因組DNA，利用PCR方法，結(jié)合T7E1分析和桑格爾測序，鑒定對小鼠MAD2L1基因編輯情況，并對轉(zhuǎn)染后的NIH/3T3細胞進行CRISPR/Cas9脫靶效應(yīng)分析。

結(jié)果： 將Cas9-MAD2L1載體轉(zhuǎn)染到NIH/3T3細胞并進行嘌呤霉素篩選后，熒光顯微鏡下觀察到大量表達GFP的細胞，PCR結(jié)合T7E1結(jié)果顯示，以轉(zhuǎn)染后的細胞DNA為模板擴增出的228 bp MAD2L1 PCR產(chǎn)物，可被酶切成166 bp和62 bp片段，測序結(jié)果顯示，成功對MAD2L1基因第二外顯子靶點處進行基因編輯，脫靶效應(yīng)分析未檢測到CRISPR/Cas9有對脫靶位點進行基因編輯。

結(jié)論： 成功建立對小鼠MAD2L1基因第二外顯子進行基因編輯的方法體系，設(shè)計的對MAD2L1基因編輯靶點未檢測到脫靶效應(yīng)的發(fā)生。