靶向標(biāo)志物GPC3（Glypican3）熒光納米探針合成路線

GPC3是在研究過度生長(zhǎng)綜合癥（Simpson-Golabi-Behmel syndrome，SGBS）時(shí)發(fā)現(xiàn)的蛋白聚糖家族成員。GPC3基因位于人X染色體上（Xq26.1）。它的啟動(dòng)子區(qū)包括6個(gè)SPI結(jié)構(gòu)、7個(gè)AP2結(jié)構(gòu)和2個(gè)CAAT盒，產(chǎn)生2 130 bp的轉(zhuǎn)錄子，編碼含580個(gè)氨基酸殘基的GPC3蛋白質(zhì)前體。GPC3核心蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為70 ku，它富含一段包括14個(gè)半胱氨酸殘基的*序列，中間為furin蛋白酶切位點(diǎn)。Furin蛋白酶裂解Arg358和Cys359形成40 ku的N末端亞基和30 ku的C末端亞基。在N末端有一種分泌型信號(hào)蛋白，C末端通過與糖基磷脂酰肌醇共價(jià)結(jié)合而錨定于細(xì)胞膜上，且硫酸乙酰肝素鏈插入點(diǎn)的位置均由C端zui末50個(gè)氨基酸所決定，使該鏈靠近細(xì)胞膜。

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       越來越多的研究表明GPC3可用于HCC常規(guī)組織檢查和潛在治療靶點(diǎn)，靶向腫瘤標(biāo)志物GPC-3的熒光納米探針的制備方法，包括如下步驟：

（1）制備以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)；

（2）取2~10ml的以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)溶液超生分散，15000rpm轉(zhuǎn)離心30~50min，加超純水0.5ml，備用；

（3）取5~20mg的碳化二亞胺（EDC），1~10mgN-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHSS）加水1.0ml溶解；

（4）取上述溶液0.3~1.0ml加入以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)溶液中，定容至1.0~5.0ml，37℃搖床反應(yīng)1~2小時(shí)；

（5）15000rpm高速離心30~50分鐘，棄上清，用pH8.5的PBS溶液250~1000μl重新溶解；

（6）加5~20μl的靶向GPC-3的單抗GC-33溶液，37℃的恒溫下，搖床反應(yīng)2~3小時(shí)，將單抗GC-33修飾到以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)的表面；

（7）15000rpm離心30~50分鐘，溶于pH7.2的PBS溶液中，分離提純得到靶向腫瘤標(biāo)志物GPC-3的熒光納米探針（GC-QDs）。

    其中，所述步驟（1）中的以ZnS為殼層的核殼結(jié)構(gòu)量子點(diǎn)為ZnO/ZnS。

本發(fā)明的上述技術(shù)方案的有益效果如下：

1.本發(fā)明中核殼結(jié)構(gòu)的量子點(diǎn)載體的合成方法避免使用三辛基膦（TOP）或磷酸三丁酯（TBP）等危險(xiǎn)試劑，安全、環(huán)保，并且步驟簡(jiǎn)單，成本低廉。

2.本發(fā)明通過改進(jìn)合成方法和核殼的結(jié)構(gòu)比率等，可制備一系列不同粒徑和結(jié)構(gòu)比例的核殼結(jié)構(gòu)的量子點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)在可見-近紅外區(qū)內(nèi)實(shí)現(xiàn)熒光可調(diào)，具有更好的熒光發(fā)光性質(zhì)，并且通過ZnS的殼層修飾降低或者消除了內(nèi)核量子點(diǎn)的生物毒性，使其具有更好的生物安全性。

3.本發(fā)明通過將GC-33修飾到量子點(diǎn)的表面制備得到高特異性、高靶向性的納米探針，通過克服生物組織對(duì)熒光干擾的影響，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌的原位、活體標(biāo)記與成像，為熒光量子點(diǎn)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論研究。

4.按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案所制備的GC-QDs納米探針，還可作為載體在制備靶向納米復(fù)合藥物中應(yīng)用。