熒光試劑 fluorescence reagent 一種有機(jī)試劑，能與熒光較弱或不顯熒光的物質(zhì)共價或非共價結(jié)合形成熒光的配合物。如8-羥基喹啉、黃酮醇、石榴茜素R、桑色素等。在它們的分子中大多含有芳香環(huán)或雜環(huán)。主要用于無機(jī)元素的熒光測定，例如，鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂以及某些稀土元素。對有機(jī)化合物也能對它們所發(fā)的熒光起加強(qiáng)、穩(wěn)定和提高選擇性的作用。

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（1）FITC

純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，zui大吸收光波長為490～495nm，zui大發(fā)射光波長為525～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用zui廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。

FITC能和各種抗體蛋白結(jié)合，結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性，并在堿性溶液中具有強(qiáng)烈的黃綠色熒光。通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測。用于醫(yī)學(xué)，農(nóng)學(xué)和畜牧等方面，可對由細(xì)菌病毒和寄生蟲等所致疾病進(jìn)行快速診斷。

FITC 是在熒光素的基礎(chǔ)上通過化學(xué)反應(yīng)增加硫氰酸基團(tuán)得到的，硫氰酸基團(tuán)可以和生物活性物質(zhì)例如蛋白質(zhì)上的伯胺基團(tuán)反應(yīng)形成硫脲鍵，從而實現(xiàn)對生物活性物質(zhì)的熒光標(biāo)記。

利用熒光素對蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。它的主要原理是利用FITC(異硫氰酸熒光素)上的N=C=S基團(tuán)和蛋白質(zhì)上游離的-NH2發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，而后在特定波長光源的激發(fā)下即可觀測到熒光信號。

（2）FAM

羧基熒光素，Carboxyfluorescein，是熒光素衍生物的一種，與FITC相比，F(xiàn)AM與氨基反應(yīng)更快，產(chǎn)物也更穩(wěn)定，但FITC結(jié)合蛋白的量更大且進(jìn)程更易于控制。FAM也適用Argon-ion Laser的488nm光譜線，Abs/Em=492/518nm（pH=9.0），具有熒光素衍生物的普遍特性，在水中穩(wěn)定。5-FAM主要應(yīng)用于DNA自動測序中，標(biāo)記其中的d/ddCTP，也經(jīng)常用于PCR產(chǎn)物定量，核酸探針等。

（3）FAM SE

由FAM酸與琥珀酸亞胺反應(yīng)得到，它是zui普遍的用來標(biāo)記肽，蛋白質(zhì)及核酸的綠色熒光試劑之一，同時也可用于配制各種小熒光分子。羧基熒光素（通常稱為FAM）和其胺反應(yīng)琥珀酸亞胺酸在生物交聯(lián)劑中比FITC更受青睞。FAM SE能提供更耐水解的甲酰胺。另外，F(xiàn)AM SE所要求的交聯(lián)環(huán)境沒其他試劑嚴(yán)格，并能提供更好的共軛產(chǎn)率，所得到的交聯(lián)結(jié)果更穩(wěn)定。FITC標(biāo)簽核酸和肽比相應(yīng)的FAM交聯(lián)物變性速度更快。在大多數(shù)生物應(yīng)用方面FAM SE試劑均可替代FITC試劑。

（4）CFDA

CFDA酯化熒光素衍生物,具有細(xì)胞滲透性，通過胞內(nèi)非特異性脂酶水解成羰基熒光素CF。與傳統(tǒng)的熒光素不同，CF帶有特殊的負(fù)電荷，能延長其在細(xì)胞內(nèi)的存留時間，它在檢測細(xì)菌內(nèi)部脂酶活性方面有著廣泛的應(yīng)用。

（5）TAMRA

TAMRA是在用的多種不同共軛物中的熒光試劑之一，可標(biāo)記蛋白質(zhì)和寡核苷酸。TAMRA具有吸光的性質(zhì)，它的光譜與幾類常用的熒光化合物重疊，TMR是明亮的橙色熒光基團(tuán)。經(jīng)常用于淬滅基團(tuán)的標(biāo)記。 5-(6）-TAMRA是由兩個不同羧基TMR單體形成的混合物 。它用來修飾氨基和羧基基團(tuán)，通過EDC介導(dǎo)的偶聯(lián)作用。它能夠與胺反應(yīng)衍生形成5（6）-TAMRA SE。TAMRA具有更強(qiáng)的光穩(wěn)定性、更高的熒光產(chǎn)量和更低的pH敏感性。