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上海莼試生物技術(shù)有限公司
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鮑球狀病毒PCR試劑盒使用方法
2020-1-20 閱讀(308)
鮑球狀病毒PCR試劑盒使用方法：
一、樣品 DNA 的制備
1. 用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
2. 如果有 N 個樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。如果用本試劑盒自帶的DNA 釋放劑試用裝。則按下面步驟操作：
3. 配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液（足夠 10 個樣品）為例：在一干凈塑料管中加入 10uL 溶液 A 成分一，20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超純水，充分混合均勻即可。溶液 A 工作液可室溫放置，但在一周內(nèi)用完，不要放置。一次檢測一個樣品需要 100uL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足夠 10 個樣品。如果待測樣品數(shù)量為其他數(shù)字，配制的溶液 A 工作液的體積需要做相應(yīng)的調(diào)整。
4. 在標(biāo)記好的 N+2 個離心管中，加入 1-5mg 固體樣品（半粒芝麻大小）或 5uL 液體樣品待測樣品。在樣品制備陽性對照中加入 5uL 陽性對照，在樣品制備陰性對照中加入 5uL 水。
5. 在每個管中加入 100 uL 溶液 A 工作液，確保固體樣品被溶液淹埋，如果是液體樣品則震蕩混勻。
6. 95℃保溫 10 分鐘。
7. 待冷卻到常溫后加入 10uL 溶液 B 并混勻得 DNA 釋放液。每個樣品得到的 DNA釋放液足夠進(jìn)行 50-100 次 PCR。
二、鮑球狀病毒PCR試劑盒 設(shè)置 PCR 反應(yīng)（40 uL 體系）
8. 在 N+2 個 PCR 管中加入下列成分，下面以樣品數(shù)為 1 舉例（注意：如果一次使用DNA 釋放劑，每個樣品設(shè)置兩個模板用量的 PCR 反應(yīng)，兩個反應(yīng)的模板使用量差 10 倍，由此確定用量，以后就用效果好的那個模板用量）：
成份
樣品（用量1）
樣品（用量2）
陽性對照
陰性對照
即用型 PCR Mix 3.0
20 uL
20 uL
20 uL
20 uL
源性 PCR 引物混合液
2 uL
2 uL
2 uL
2 uL
制備的樣品
18 uL
2 uL
無
無
樣品制備陽性對照
不加
不加
2 uL
不加
樣品制備陰性對照
不加
不加
不加
2 uL
超純水
不加
16 uL
16 uL
16 uL
9. 輕柔混勻后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR。
過程
溫度
時(shí)間
預(yù)變性
94℃
10分鐘
PCR 反應(yīng)
（35 個循環(huán)）
94℃
30s
60℃
30s
72℃
30s
延伸
72℃
7分
10. 電泳檢測 PCR 產(chǎn)物。預(yù)期的 PCR 產(chǎn)物長度為 216bp。陽性對照必須有此條帶出
現(xiàn)，陰性對照必須無任何擴(kuò)增，否則實(shí)驗(yàn)無效。對沒有擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品，需要用通用引物（如真核生物專一 PCR 引物，需自備）測試是否有抑制劑或樣品是否濃度達(dá)到 PCR 的要求，如果通用引物也擴(kuò)不出來，需要濃縮并再次純化 DNA 樣品，或者更換 DNA 提取方法，直到通用引物能夠擴(kuò)增出預(yù)計(jì)大小的片段。
