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細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：
一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備RPMI-1640培養(yǎng)基，90%；優(yōu)質胎牛血清，10%。
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲存。
二．細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
公司產(chǎn)品僅用于科研以下是細胞的訂購信息：

英文簡稱：LU65細胞    

產(chǎn)品名稱：大細胞肺癌

規(guī)格：T25

形態(tài)特性：成纖維細胞

生長特性：貼壁生長

特征特性：

培養(yǎng)條件：RPMI1640+10%FBS

傳代方法：1:10傳代

貨號：CS-X64072

細胞培養(yǎng)的優(yōu)點：
1.研究的對象是活細胞
在實驗過程中，根據(jù)要求可始終保持細胞活力，并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細胞的情況，包括活細胞的形態(tài)、結構、生命活動等。
2.研究條件可以人為控制
pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學的條件，可以根據(jù)實際需要進行人為的控制，同時，可以施加化學、物理、生物等因素作為條件而進行實驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴格控制之下。
3.研究的樣本可以達到比較均一性
通過細胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細胞系則可以達到均一性而屬于同一類型的細胞，需要時，可采用克隆化等方法使細胞達到純化。
4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄
采用各種研究技術：如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細胞術、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學、原位雜交、同位素標記等各種儀器設備。

注意事項：
（1）凍存前細胞狀態(tài)，細胞在對數(shù)生，細胞密度適合，剛剛發(fā)生細胞融合，過密或連成片的細胞狀態(tài)不好，而且消化時不容易分散；
（2）凍存的密度不宜過低，10的6次方-7次方的數(shù)量級比較好，我凍存的細胞一般T25培養(yǎng)瓶（5*107），一瓶凍一管（1.5ml凍存管），10cm培養(yǎng)皿（大概10的8次方個細胞）分成兩管。
（3）消化和吹打，切忌消化過度，吹打不可太用力，不要吹出好多泡泡。消化后立即加入*培養(yǎng)基吹打哦，不是加入凍存液再吹打。
（4）離心后加入凍存液。凍存液中FBS的用量對于腫瘤細胞株而言要求不是很嚴格，我從10%-90%都用過，問題不大，個人認為10%-20%可以了，能節(jié)約處就節(jié)約點嘛！另外，凍存液可以在處理細胞前配置，放在4度冰箱預冷。細胞離心后直接用預冷的凍存液重懸，移入凍存管。
（5）關于“慢凍"，傳統(tǒng)的方法，LLC細胞凍存管用棉花包好，4度2h，-20度2h或更長，-80度過夜，最后液氮。對于條件較好的實驗室和細胞凍存數(shù)量多的實驗室，使用程序降溫盒，內(nèi)裝異丙醇，在-80度并內(nèi)可以逐漸降溫，很方便，省了包棉花、4度、-20度了。
實驗報告
一、產(chǎn)分離與培養(yǎng)：
   1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將成1mm3左右大小；
   2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；
   3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；
   4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
   5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；
二、免疫熒光鑒定：
   1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；
   2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
   3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；
   4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；
   5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；
   6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。
Mdm2p53結合蛋白同源物(MDM2)檢測試劑盒英文名稱：MDM2 ELISA Kit磷酸化半蛋白酶9抗體包裝1g

M2-型丙酮酸激酶(PKM2)檢測試劑盒英文名稱：PKM2 ELISA Kit磷酸化半蛋白酶9抗體包裝250mg

L-型電壓依賴性鈣離子通道α1D亞基(CACNα1D)檢測試劑盒英文名稱：CACNα1D ELISA Kit磷酸化β 連環(huán)素蛋白抗體包裝5g

L-型電壓依賴鈣離子通道α1S亞基(CACNα1S)檢測試劑盒英文名稱：CACNα1S ELISA Kit磷酸化β 連環(huán)素蛋白抗體包裝1g

L-型電壓依賴鈣離子通道α1F亞基(CACNα1F)檢測試劑盒英文名稱：CACNα1F ELISA Kit磷酸化β 連環(huán)素蛋白抗體包裝5g

L-型電壓依賴鈣離子通道α1C亞基(CACNα1C)檢測試劑盒英文名稱：CACNα1C ELISA Kit磷酸化β 連環(huán)素蛋白抗體包裝5g

Lin-28同源物A(LIN28A)檢測試劑盒英文名稱：LIN28A ELISA Kit造血干抗原CD133抗體包裝50mg

L1-細胞粘附分子(L1CAM)檢測試劑盒英文名稱：L1CAM ELISA Kit1號染色體開放閱讀框138抗體包裝100mg

Kruppel樣因子1(KLF1)檢測試劑盒英文名稱：KLF1 ELISA Kit6號染色體開放閱讀框50抗體包裝1g

Klotho蛋白(KL)檢測試劑盒英文名稱：KL ELISA Kit1號染色體開放閱讀框151抗體包裝25ml

Klothoβ蛋白(KLβ)檢測試劑盒英文名稱：KLβ ELISA Kit腫瘤壞死因子受體超家族成員9抗體包裝5ml

Ki-67蛋白(Ki67P)檢測試劑盒英文名稱：Ki67P ELISA Kit復合前列腺特異性抗原單克隆抗體包裝100g

JunB原癌基因(JUNB)檢測試劑盒英文名稱：JUNB ELISA Kit組織蛋白酶z抗體包裝25g

Jagged1蛋白(JAG1)檢測試劑盒英文名稱：JAG1 ELISA Kit2號染色體開放閱讀框84抗體包裝1g

IL2誘導T細胞激酶(ITK)檢測試劑盒英文名稱：ITK ELISA Kit磷酸化鈣/鈣調素依賴蛋白激酶2α抗體包裝1g
LU65細胞阿利苯多(標準品)英文名稱： Dexamethasone AcetateCD44V5抗體包裝25g

阿侖磷酸鈉（標準品）英文名稱： Dexamethasone Acetate22號染色體開放閱讀框23抗體包裝5g

（標準品）英文名稱： Trimethoprim角蛋白19抗體包裝1g

阿尼西坦(標準品)英文名稱： Trimethoprim1號染色體開放閱讀框147抗體包裝5g

阿齊沙坦(標準品)英文名稱： Sivelestat sodium 膽固21-羥化酶抗體包裝1g

（標準品）英文名稱： Nevirapine畸胎瘤衍化生長因子抗體(C端)包裝25g

阿米特（標準品）英文名稱： Nevirapine補體C1qL3鏈多肽抗體包裝5g

阿司咪唑(標準品)英文名稱： Sulfamethoxazole(SMZ)腫瘤/抗原27抗體（高遷移率族蛋白）包裝100g

阿糖腺苷(標準品)英文名稱： Sulfamethoxazole(SMZ)1號染色體開放閱讀框228抗體包裝25g

（標準品）英文名稱： Cefpirome Sulfate碳酸酐酶3抗體包裝5g

阿托伐醌,阿托喹酮（標準品）英文名稱： Cefpirome Sulfate親環(huán)蛋白（親環(huán)素）PPIA抗體包裝1g

阿魏酸鈉(標準品)英文名稱： Amisulpride鈣網(wǎng)蛋白抗體包裝250mg

阿魏酸哌（標準品）英文名稱： Amisulpride腫瘤/抗原65包裝5g

阿西美辛(標準品)英文名稱： Fenofibric acid2號染色體開放閱讀框25抗體包裝1g

，阿西莫司（標準品）英文名稱： Fenofibric acid伴侶蛋白9抗體包裝5g