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多點(diǎn)突變?cè)噭┖斜驹噭┖惺抢靡粚?duì)設(shè)計(jì)特殊的錨定引物（Anchor Primer）及幾條定點(diǎn)突變引物對(duì)DNA多個(gè)不同位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行定點(diǎn)突變的試劑盒。錨定引物“尾巴"上的特異性序列是與大多數(shù)基因都不相匹配的，因此保證了PCR擴(kuò)增的特異性。本試劑盒的主要原理是：設(shè)計(jì)合成同一方向的錨定引物及定點(diǎn)突變引物，將錨定引物及定點(diǎn)突變引物用T4聚核苷酸激酶磷酸化后與模板質(zhì)粒DNA進(jìn)行退火，再使用T4 DNA聚合酶和T
多點(diǎn)突變?cè)噭┖?/strong>
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多點(diǎn)突變?cè)噭┖?/strong> | 20次 | 詢價(jià) |
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本試劑盒是利用一對(duì)設(shè)計(jì)特殊的錨定引物（Anchor Primer）及幾條定點(diǎn)突變引物對(duì)DNA多個(gè)不同位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行定點(diǎn)突變的試劑盒。錨定引物“尾巴”上的特異性序列是與大多數(shù)基因都不相匹配的，因此保證了PCR擴(kuò)增的特異性。本試劑盒的主要原理是：設(shè)計(jì)合成同一方向的錨定引物及定點(diǎn)突變引物，將錨定引物及定點(diǎn)突變引物用T4聚核苷酸激酶磷酸化后與模板質(zhì)粒DNA進(jìn)行退火，再使用T4 DNA聚合酶和T4 DNA連接酶進(jìn)行延伸和連接形成突變單鏈，然后使用錨定引物“尾巴”上的特異性引物（ETail F/ETail R）和高保真DNA聚合酶對(duì)突變單鏈進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將獲得的雙鏈PCR產(chǎn)物克隆回原載體中，即可達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康模@得目的突變體。本試劑盒操作快速簡單，只需一天時(shí)間便可以完成整個(gè)突變操作。本試劑盒尤其適用于插入片段長度在1.0 kb以下的多位點(diǎn)基因突變實(shí)驗(yàn)，對(duì)于1.0 kb以上的DN段的多位點(diǎn)基因突變，由于引物退火的不*、PCR擴(kuò)增中可能引入新的突變點(diǎn)等原因，可能降低實(shí)驗(yàn)成功率。本公司曾經(jīng)使用本試劑盒，成功進(jìn)行了1.5 kb DN段的多位點(diǎn)基因突變實(shí)驗(yàn)。本試劑盒中的Anchor F1和Anchor R1引物可供克隆于pUC系列載體或pBluescript系列載體中的DN段的多位點(diǎn)基因突變實(shí)驗(yàn)，使用方便。使用試劑盒中的Control質(zhì)粒及各種Control實(shí)驗(yàn)用引物可進(jìn)行Control實(shí)驗(yàn)。
RNA提取法：試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA，有機(jī)層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、RNA的提取;
2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
3、PCR擴(kuò)增;
4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在zui條件下進(jìn)行。
堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)*分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
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