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上海博湖生物科技有限公司
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PCR實驗循環步驟分述
2023-10-8 閱讀(585)
聚合酶鏈反應(PCR)技術是在體外進行的由引物介導的酶促DNA擴增反應。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTP)及適當濃度的Mg2+存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的體外酶促合成反應。根據PCR使用說明進行試劑混合預配，并設置 PCR 循環。簡而言之，PCR需要經過以下循環：
1. 初始化步驟
這僅對熱啟動 PCR 必不ke少。此步驟將溶液加熱至 94-98°C，以激活 DNA 聚合酶。該步驟的時間取決于所使用的聚合酶。
2. 變性步驟
DNA是雙鏈分子，DNA擴增需要引物與單鏈DNA模板相互作用。在此步驟中，將反應混合物加熱至 94-98°C 并保持 20-30 秒，以破壞兩條鏈之間的氫鍵并生成單鏈 DNA 分子。此時進入 PCR 循環。
3. 退火步驟
變性后，反應混合物中的 DNA 模板是單鏈的。由于引物與DNA模板互補，當反應溫度降低到50-65℃時，引物會與模板序列匹配，互補堿基之間形成氫鍵。退火溫度取決于所用引物的Tm，一般比引物Tm低3-5℃左右。該步驟將持續約 20-40 秒以wan全退火，然后聚合酶將定位到引物-模板雜交體以開始 DNA 組裝。
4. 伸長步驟
在此步驟中，DNA 聚合酶開始合成 DNA，因此溫度應為 DNA 聚合酶的最適溫度。一般選擇 72°C，但有些酶在 68°C 時效果更好。這一步與體內DNA復制非常相似，DNA聚合酶將dNTPs添加到引物中，以5'到3'方向與模板互補，最終產生新的雙鏈DNA片段。延伸時間取決于目標 DNA 片段的長度和 DNA 聚合酶的能力。一般來說，DNA 聚合酶每 60 秒產生一千個堿基。
5. 2~4步稱為一個循環，每循環一次，目標片段量翻倍。一個 PCR 過程使用 30-35 個循環。在 PCR 循環的早期，PCR 產物以指數速率積累，而在 PCR 循環的后期，隨著 dNTPs、引物的減少和 DNA 聚合酶在變性溫度下的失活，反應減慢，PCR 速率逐漸下降。
6.最終伸長率。30-35個循環結束后，在68-74℃的溫度下最終延伸約5-10分鐘，以充分延伸剩余的單鏈DNA。
7.貯存。最終產品可以在 PCR 機器中維持溫度在 4-10°C。
