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上海博湖生物科技有限公司
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ELISA實(shí)驗(yàn)包驗(yàn)被抗原與包被細(xì)胞步驟
2024-10-14 閱讀(340)
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)寫ELISA）指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。
一、包被抗原
1. 用 50mM 的碳酸鹽包被緩沖液(pH 9.6)溶解抗原，使抗原濃度為 10-20 μg/ ml， 加 100 μl/孔到 96 孔酶標(biāo)板， 4 oC 放置過夜。
2. 第二天棄去包被液后， 用 PBST 洗滌 3 次，每孔加入 150 μl 1% BSA 37 oC封閉 1 小時(shí)。
3. PBST 洗滌 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀釋度的血清，并加入對(duì)照樣品， 37 oC 孵育 2 小時(shí)。
4. PBST 洗滌 5 次后，加入 100μl 稀釋后的 HRP 標(biāo)記的二抗，37 oC 孵育 1 小時(shí)。
5. PBST 洗滌 5 次后，顯色劑顯色 20min 后，酶標(biāo)儀上讀取 A405 吸收值。
二、包被細(xì)胞
1. 在 96 孔培養(yǎng)板上接種細(xì)胞數(shù)為 1 x 104 cells/well ，37℃過夜培養(yǎng)。
2. 第二天用 PBS 洗滌培養(yǎng)板 2-3 次。
3. 加入 125 µl/well 10% Formalin(1:10 稀釋) , 室溫下固定 15 min。
4. 用 ddH2O 洗滌培養(yǎng)板 3 次，并晾干，儲(chǔ)藏在 2-8oC 備用。
5. 用 PBST 洗滌 3 次，每孔加入 150 μl 1% BSA 37 oC 封閉 1 小時(shí)。
6. PBST 洗滌 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀釋度的血清，并加入對(duì)照樣品， 37 oC 孵育 2 小時(shí)。
7. PBST 洗滌 5 次后， 加入 100 μl 稀釋后的 HRP 標(biāo)記的二抗,37 oC 孵育 1 小時(shí)。
8. PBST 洗滌 5 次后，顯色劑顯色 20min 后，酶標(biāo)儀上讀取 A405 吸收值。
50mM 的碳酸鹽包被緩沖液： 0.05mol/L pH9.6 碳酸緩沖液,4℃,保存, Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克,蒸餾水稀釋至 100 ml。
ABTS 作為底物進(jìn)行顯色反應(yīng)(10ml)：
1)、0.2M Na2HPO4 2.4ml
2)、0.1M 檸檬酸 2.6ml
3)、ddH2O 5ml
4)、ABTS 5mg
5)、H2O2(30%) 4 ul(用前加入)
注 意：
1、一般做倍比稀釋進(jìn)行檢測(cè)，需要有相應(yīng)的對(duì)照血清。
2、不同的顯色系統(tǒng)對(duì)應(yīng)不同的光吸收值。
