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上海雅吉生物科技有限公司
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質粒提取步驟
2021-9-1 閱讀(3843)
一、實驗原理：
堿裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA 與線性染色體DNA 在拓撲學上的差異來分離它們。在pH 值介于12.0 ～12.5 這個狹窄的范圍內，線性的DNA 雙螺旋結構解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環質粒DNA 的氫鍵會被斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結合在一起。當加入pH 4.8 的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復pH 至中性時，共價閉合環狀的質粒DNA 的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確，而線性的染色體DNA 的兩條互補鏈彼此已*分開，復性就不會那么迅速而準確，它們纏繞形成網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA ，蛋白質-SDS 復合物等一起沉淀下來而被除去。
二、操作步驟：
1. 準備20ml滅菌過的培養管，編號，分別加入8ml LB培養基，再加入8µl 相應抗生素，可適量多加；
2. 用10µl 白色槍頭挑取挑取單個菌落至培養管中，37℃震蕩過夜（274rpm）；
3. 取2ml過夜培養的菌液加入離心管中，室溫10000rpm離心2min，去上清；（可重復步驟2，直至菌液離心完）（去上清時用紙吸一下）
4. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250µl Buffer P1（含RNase A），使用移液槍充分混勻，懸浮菌體菌體；
5. 向離心管中加入250µl Buffer P2，溫和地上下顛倒混勻4~6次，獲得澄清的裂解液；（劇烈混合會使剪切染色體DNA，降低質粒純度）
6. 向離心管中加入350µl Buffer N3， 立即溫和地上下顛倒混勻4~6次，此時出現白色絮狀沉淀。室溫10000rpm離心15min；
7. 小心將步驟6中所得的上清液轉移至潔凈的吸收柱中。要保證沒有吸入沉淀和細胞碎片。室溫10000rpm離心1min，至裂解物*通過吸收柱,倒掉收集管中的廢液；
8. 向吸附柱中加150µl Buffer PB，10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液；
9. 向吸附柱中加400µl Buffer PW（檢查是否加入無水乙醇），10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液。再空離一次，2min（此時可以加熱 Buffer EB，65~70℃）；
10. 將吸附柱置于一個新的離心管中，打開蓋子，吹風4min左右（確保乙醇被去除，乙醇會影響下面的步驟）；
11. 向吸附柱的吸附膜中間部位加90µl Buffer EB（pET系列拷貝數低，加EB 70μl即可），室溫靜置2min。10000rpm離心1min；
12. 把液體倒回吸附柱，在10000rpm離心1min；
13. 混合質粒至一個離心管中，做好標記，開蓋室溫放置兩小時左右。-40℃保存質粒。
三、注意事項：
1.使用之前，把試劑盒中的一小管RNA酶加入Buffer P1， 4℃保存。
2.Buffer EB在65~70℃水浴預熱，可以增加提取效率。
